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PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒--MagExtractor®-PCR & Gel Clean u

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-05-22
產(chǎn)品索引 5872
中文名稱(chēng): PCR產(chǎn)物及凝膠回收試劑盒
英文名稱(chēng): MagExtractor®-PCR & Gel Clean up-
產(chǎn)品編號(hào): NPK - 600

產(chǎn)品類(lèi)別:

分子生物學(xué)
生產(chǎn)廠(chǎng)家: TOYOBO
產(chǎn)品價(jià)格: 300元
產(chǎn)品規(guī)格: 50次
DNA Fragment Purification Kit
MagExtractor®
-PCR & Gel Clean up-
使用說(shuō)明書(shū)
(Code No. : NPK – 601)
TOYOBO CO. , LTD.Biochemical Operation Department
OSAKAJAPAN
 —目錄—
[1] 前言 ........................................................................................... 1
[2] 純化流程...................................................................................... 2
[3] 試劑盒中所包含的物品................................................................. 3
[4] 試劑盒以外所需要的其他物品...................................................... 3
[5] 回收DNA溶液............................................................................. 4
[6] 回收瓊脂糖凝膠........................................................................... 5
[7] 疑難解答...................................................................................... 8
 
注意:
       本試劑盒中所包含的都是研究用試劑。請(qǐng)不要用于診斷,臨床等場(chǎng)合。在使用本試劑盒的時(shí)候,請(qǐng)嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室的基本注意事項(xiàng),注意安全。由于本試劑盒內(nèi)含有對(duì)人體有害的試劑,所以請(qǐng)務(wù)必嚴(yán)格遵守各試劑的相關(guān)使用說(shuō)明書(shū),按要求使用保護(hù)罩等防護(hù)措施。

 [1] 前言
       MagExtractor - PCR & Gel Clean up-利用在Chaotropic(鹽)試劑存在的情況下,核酸能吸附在硅膠上的特性1,用于手動(dòng)對(duì)DNA片段進(jìn)行純化。本試劑盒采用磁硅膠粒子,若使用磁性臺(tái)架,則能最大限度地減少?gòu)?fù)雜的離心操作,能夠快速地的純化DNA片段。
1)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76(2) 615-619(1979)
特征
·從DNA溶液(約100μl),以及TAE·TBE瓊脂糖凝膠(約0.3g)中,
能夠以平均回收率60~70%比例回收DNA片段(約100bp~50kbp)。
·能夠在5分鐘之內(nèi)從DNA溶液中,或者在15分鐘之內(nèi)從瓊脂糖凝膠
中回收DNA片段。
·由于在室溫下瓊脂糖凝膠可以被融解,因此無(wú)需進(jìn)行加熱反應(yīng)。
 
* 要徹底去除混雜在回收液中的乙醇時(shí)則需要進(jìn)行加熱處理(55℃)。
試劑盒的用途
·脫鹽,去除dNTPs。
·去除引物。
·去除酶(堿性磷酸酶等)。
·從電泳后的瓊脂糖凝膠塊中回收DNA。
回收的DNA的用途
·RI.Non-RI測(cè)序反應(yīng)
·限制酶反應(yīng)
·標(biāo)記反應(yīng)
·雜交反應(yīng)
·連接反應(yīng)
·轉(zhuǎn)化反應(yīng)
·擴(kuò)增反應(yīng)
[2] 純化流程      
 下圖顯示為使用MagExtractor-PCR &
  Gel Clean up-時(shí)的純化流程。

純化DNA片段
Elute
75%乙醇
洗凈液
溶出液
     磁石
磁性或離心分離
磁珠
Wash
 
Bind
 
Melt
 
凝膠塊
吸附液
電泳后的凝膠

[3] 試劑盒中所包含的物品    
 
       本試劑盒中包含以下試劑。(200次份)
      
 
試劑量
保存條件
吸附液*
88ml
避光室溫保存
洗凈液*
132ml
室溫保存
磁珠
7ml
室溫保存
 
*吸附液,洗凈液在低溫情況下會(huì)析出結(jié)晶。請(qǐng)一邊用手捂暖,一邊
將其倒轉(zhuǎn)混合讓結(jié)晶溶解后使用。另外,吸附液及洗凈液內(nèi)含有蛋白
變性劑。在使用時(shí)務(wù)必注意,萬(wàn)一沾到身體,請(qǐng)立刻用清水沖洗。
 
[4] 試劑盒以外所需要的其他物品
 
1.試劑
·滅菌蒸餾水<溶出液>
·75%乙醇<洗凈用>
 
2.器具,器材
·1.5ml小型試管用磁性臺(tái)架
·簡(jiǎn)易臺(tái)式離心機(jī)
·漩渦混合器
·Heat Block 55℃(用于在需要去除混于回收液中的乙醇的場(chǎng)合)
 
*可使用本公司的磁性臺(tái)架Magical Trapper(Code No.:MGS-101)等產(chǎn)品。
 [5] 回收DNA溶液
 
1.前言
·本操作程序用于從DNA溶液(約100μl)中回收DNA片段。
·能夠回收的DNA大小約為100bp~50kb。另外,40bp以下的核酸
幾乎能夠被加以除去。
· 磁珠的最大吸附量為每30μl磁珠大約吸附5μg。使用時(shí)請(qǐng)以2.5μg左右為參考量。
·能夠從PCR反應(yīng)液,限制酶反應(yīng)溶液,堿性磷酸酶反應(yīng)液等各種反
應(yīng)液中回收DNA。
·回收后的DNA,能夠用于限制酶處理、測(cè)序、連接、標(biāo)記、雜交等多種反應(yīng)
2.操作程序      
DNA溶液(100μl)1
↓← 400μl吸附液
↓← 30μl磁珠2)
↓不時(shí)用漩渦混合器攪拌,并放置約1~2min(室溫)
B/F(固/液)分離3
↓←(600μl洗凈液)4
↓漩渦混合器攪拌10sec,
B/F分離。3
↓←1ml75%乙醇4
↓漩渦混合器攪拌10sec,
B/F分離。3
瞬時(shí)高速離心,徹底去除上清部分。
(打開(kāi)小型試管的蓋子,55℃下放置5min,干燥)4
↓←25~100μl蒸餾水
↓漩渦混合器攪拌10sec,
(在無(wú)法充分將粒子分離的情況下,請(qǐng)用pipetting來(lái)分離粒子。)
↓放置2min
B/F分離,回收上清液。5
1)請(qǐng)盡量不要含礦物油。
2)使用磁珠前,請(qǐng)徹底懸濁混合后再使用。
3)將試管放置在磁性臺(tái)架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持續(xù)去除
上清部分。通過(guò)乙醇清洗時(shí),可以通過(guò)將上清液倒入其他容器進(jìn)行去除。
B/F分離時(shí)推薦使用對(duì)應(yīng)于微型試管的磁性臺(tái)架,但也可用簡(jiǎn)易臺(tái)式離心機(jī),用大約6,000r.p.m程度,5sec.的離心進(jìn)行分離。g會(huì)根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化,所以請(qǐng)調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù),使得能更有效地集合粒子,并保證凝結(jié)不至于過(guò)度。
4)請(qǐng)參照3.的表。
5)回收液中少量混入的磁珠并不會(huì)有礙下一次的反應(yīng),但在測(cè)定吸附度
等場(chǎng)合時(shí),請(qǐng)通過(guò)瞬時(shí)高速離心除去磁珠。
 
3.關(guān)于工序的省略,純化規(guī)模
·洗凈工序,加熱工序可以省略(請(qǐng)參照下表)
用途
洗凈
干燥
備注
洗凈液
75%乙醇溶液
測(cè)序,限制酶反應(yīng),連接反應(yīng)等的前處理
1
標(biāo)準(zhǔn)操作程序;厥盏暮怂崮苡糜Low Buffer系列的限制酶切斷。
鹽的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合
2
吸附液和洗凈液含有高濃度的鹽分。
乙醇的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合
1次(2次)
55℃,5min
用于易受乙醇影響的前處理。
要去除混入的酶的場(chǎng)合
1
1次(2次)
用于去除堿性磷酸酶等。
要通過(guò)吸光度來(lái)準(zhǔn)確定量核酸濃度的場(chǎng)合
1
2
吸附液內(nèi)含有能吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)。
 
·根據(jù)DNA溶液的量,可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
液和磁珠的使用量。此時(shí),無(wú)需減少75%乙醇溶液的使用量。
[6] 回收瓊脂糖凝膠
 1.前言
·本操作程序適用于從TAE或者TBE瓊脂糖凝膠(約0.3g)中回收
DNA片段。本操作程序是以瓊脂糖濃度2%以下的凝膠為對(duì)象。
要使用2%以上的凝膠時(shí),推薦所使用凝膠的量少于0.3g。另外,本
操作程序不需要使用特殊的低融點(diǎn)瓊脂糖凝膠。
·能夠回收的DNA大小約為100bp~50kbp。
·回收后的DNA主要用于連接反應(yīng)、標(biāo)記、測(cè)序等反應(yīng)。
 
2.操作程序
瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色。
在UV照射下(Long wave),為了使得目標(biāo)條帶盡可能地變小,使
用切割刀或手術(shù)刀等進(jìn)行切開(kāi)。
把切開(kāi)的瓊脂糖切細(xì),放到1.5ml小型試管中。(此時(shí)稱(chēng)得重量,如
果大于0.3g則分幾次進(jìn)行。)1
↓←400μl吸附液
在凝膠完全溶解之前,將其放置在室溫中,并不時(shí)進(jìn)行攪拌。2
↓←30μl磁珠3
↓經(jīng)常用漩渦混合器攪拌,并放置2min(室溫),
B/F分離。4
↓←600μl洗凈液
↓漩渦混合器攪拌10sec,
B/F分離。4
↓←1ml75%乙醇溶液5
↓漩渦混合器攪拌10sec,
B/F分離。4
瞬時(shí)高速離心,徹底去除上清部分。
(打開(kāi)微型試管的蓋子,55℃下放置5min,干燥)5

 
↓←25~100μl蒸餾水
↓漩渦混合器攪拌10sec
(在無(wú)法充分分開(kāi)粒子的情況下,請(qǐng)用pipetting來(lái)分散粒子。)
↓放置2min
B/F分離,回收上清液6
 
1)   將瓊脂糖凝膠制成切片,以利于溶解。
2)   如果想要快速溶解瓊脂糖凝膠或凝膠難以溶解時(shí),請(qǐng)加溫至55℃
5min。
3)   使用磁珠前,請(qǐng)徹底混合后再使用。
4) 將試管放置在磁性臺(tái)架上,把磁珠挪近磁石,用微量移液器持續(xù)去
除上清部分。要洗凈乙醇,也可以通過(guò)將上清液倒入其他容器來(lái)去除。
B/F分離時(shí)推薦使用對(duì)應(yīng)于微型試管的磁性臺(tái)架,但也可使用簡(jiǎn)易臺(tái)式離心機(jī),用大約6,000r.p.m程度,5sec.的離心進(jìn)行分離。g會(huì)根據(jù)離心機(jī)的轉(zhuǎn)子口徑而發(fā)生變化,故請(qǐng)調(diào)整旋轉(zhuǎn)數(shù),使得更有效地集合粒子,并保證凝結(jié)不至于過(guò)度。
5) 請(qǐng)參照3.的表。
6) 回收液中混入少量磁珠并不會(huì)有礙下一次的反應(yīng),但在測(cè)定吸附
度等場(chǎng)合時(shí),請(qǐng)通過(guò)瞬時(shí)高速離心除去磁珠。
 
3.關(guān)于工序的省略,純化規(guī)模
·洗凈工序,加熱工序可以省略(請(qǐng)參照下表)
用途
洗凈
干燥
備注
洗凈液*
75%乙醇溶液
連接反應(yīng), 測(cè)序等
1
1
標(biāo)準(zhǔn)操作程序。
鹽的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合
1
2
吸附液和洗凈液中含有高濃度的鹽分。
乙醇的混入會(huì)產(chǎn)生影響的場(chǎng)合
1
1次(2次)
55℃,5min
用于容易受乙醇影響的前處理。
要通過(guò)吸光度來(lái)準(zhǔn)確定量核酸濃度的場(chǎng)合
1
2
吸附液內(nèi)含有吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)。
*從瓊脂糖凝膠中回收核酸時(shí),必須用洗凈液清洗。

 
·根據(jù)DNA溶液的量,可以按比例減少本試劑盒中附帶的吸附液、洗凈
液和磁珠的使用量。此時(shí),無(wú)需減少75%乙醇溶液的使用量。
      
[7] 疑難解答      
 1.回收量低
原因
對(duì)策
去除乙醇不徹底
瞬時(shí)高速離心后,請(qǐng)仔細(xì)去除75%乙醇溶液。
溶出不充分
通過(guò)10mM Tris-HCIpH8.0),或者TE buffer能夠提高溶出的效率。另外,如果加溫至55℃保持2min能夠更加有效地提高溶出效率。
吸附時(shí)間不合適
如果吸附過(guò)剩,回收量則會(huì)變少。最恰當(dāng)?shù)奈綍r(shí)間是,對(duì)于DNA溶液為12min,對(duì)于凝膠則為2min
溶出時(shí)的攪拌不充分
溶出時(shí),如果磁珠的混合不充分,回收量會(huì)減少。在瞬時(shí)高速離心后,磁珠會(huì)在底部結(jié)塊,請(qǐng)仔細(xì)將其散開(kāi)。特別是在從瓊脂糖凝膠中進(jìn)行純化的時(shí)候,結(jié)塊的磁珠會(huì)比較難以重新散開(kāi)。
瓊脂糖凝膠的量大于0.3g
請(qǐng)減少瓊脂糖凝膠的量。
使用2%以上的瓊脂糖
請(qǐng)減少瓊脂糖凝膠的量。
沒(méi)有用洗凈液清洗
從瓊脂糖凝膠中回收DNA時(shí),請(qǐng)務(wù)必先用洗凈液清洗。
 
2.回收的核酸的吸光度不準(zhǔn)確
原因
對(duì)策
清洗不充分
吸附液中含有吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)。要對(duì)回收的核酸定量,請(qǐng)用洗凈液以及75%乙醇溶液來(lái)清洗。
混入了吸附液
吸附液中含有吸收紫外線(xiàn)的物質(zhì)。請(qǐng)仔細(xì)去除吸附液。用面紙等擦拭試管的蓋子上沾有的吸附液,可以有效改善狀況。
 

 
3.回收后的核酸不能良好地進(jìn)行反應(yīng)
       原因
對(duì)策
鹽阻礙了反應(yīng)
請(qǐng)?zhí)砑觾纱?/span>75%乙醇溶液進(jìn)行清洗的工序。吸附液和洗凈液都含有高濃度的鹽分。
乙醇阻礙了反應(yīng)
請(qǐng)按照操作程序,對(duì)乙醇進(jìn)行干燥處理。
酶未能完全去除
要去除反應(yīng)液中的堿性磷酸酶等酶,請(qǐng)用洗凈液以及75%乙醇溶液進(jìn)行清洗。
反應(yīng)用的酵素過(guò)少
從瓊脂糖凝膠中回收核酸時(shí),反應(yīng)用的酶量應(yīng)比通常要多,這樣就能得到準(zhǔn)確良好的結(jié)果。
使用的瓊脂糖級(jí)別不夠
請(qǐng)使用高級(jí)別的瓊脂糖。
從瓊脂糖凝膠中分離條帶時(shí),受到的紫外線(xiàn)照射過(guò)多
請(qǐng)用Long wave365nm附近)的紫外線(xiàn)來(lái)進(jìn)行切片工作。
 
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