產(chǎn)品索引 | 5871 |
中文名稱: | 植物基因組DNA提取試劑盒 |
英文名稱: | MagExtractor®-Plant Genome- |
產(chǎn)品編號: | NPK- 500 |
產(chǎn)品類別: |
分子生物學(xué) |
生產(chǎn)廠家: | TOYOBO |
產(chǎn)品價格: | 800元 |
產(chǎn)品規(guī)格: | 50次 |
Nucleic Acid Purification Kit
MagExtractor
-Plant Genome-
使用說明書
(Code No.:NPK- 500)
TOYOBO CO., LTD. Biochemical Operations Department
OSAKAJAPAN
(Code No.:NPK- 500)
TOYOBO CO., LTD. Biochemical Operations Department
OSAKAJAPAN
—目錄—
目錄 頁數(shù)
1.前言.......................................................................................................................... 1
2.使用前須知.............................................................................................................. 1
3.試劑盒中所包含的物品.......................................................................................... 2
4.操作程序.................................................................................................................. 2
1]試劑盒以外所需要的其他物品...................................................................... 2
(1)試劑............................................................................................................. 2
(2)器具及器材................................................................................................. 3
2]抽提流程.......................................................................................................... 3
3]樣品前處理...................................................................................................... 4
4]使用MFX-2000進(jìn)行Plant DNA抽提......................................................... 4
(1)操作程序的選擇......................................................................................... 4
(2)加溫block以及回收block溫度的設(shè)定.................................................. 4
(3)附帶專用過濾器的tip安裝....................................................................... 5
(4)專用試管的安裝......................................................................................... 5
(5)試劑的安裝................................................................................................. 6
(6)樣品的安裝................................................................................................. 8
(7)抽提開始..................................................................................................... 8
(8)樣品的回收................................................................................................. 8
5]使用手工方法進(jìn)行Plant DNA抽提............................................................. 8
5.一般樣品的分析...................................................................................................... 9
1]DNA定量測定................................................................................................ 9
2]電泳............................................................................................................... 10
3]PCR............................................................................................................... 10
6.抽提實例................................................................................................................ 10
7.疑難解答................................................................................................................ 11
注意事項
本試劑盒中所包含的所有試劑屬研究用試劑。請不要用于診斷或臨床等場合。在使用本試劑盒的時候,請嚴(yán)格遵守常用的實驗室安全操作程序。
Hoffman-La Roche Ltd.擁有PCR方法的專利權(quán)。
目錄 頁數(shù)
1.前言.......................................................................................................................... 1
2.使用前須知.............................................................................................................. 1
3.試劑盒中所包含的物品.......................................................................................... 2
4.操作程序.................................................................................................................. 2
1]試劑盒以外所需要的其他物品...................................................................... 2
(1)試劑............................................................................................................. 2
(2)器具及器材................................................................................................. 3
2]抽提流程.......................................................................................................... 3
3]樣品前處理...................................................................................................... 4
4]使用MFX-2000進(jìn)行Plant DNA抽提......................................................... 4
(1)操作程序的選擇......................................................................................... 4
(2)加溫block以及回收block溫度的設(shè)定.................................................. 4
(3)附帶專用過濾器的tip安裝....................................................................... 5
(4)專用試管的安裝......................................................................................... 5
(5)試劑的安裝................................................................................................. 6
(6)樣品的安裝................................................................................................. 8
(7)抽提開始..................................................................................................... 8
(8)樣品的回收................................................................................................. 8
5]使用手工方法進(jìn)行Plant DNA抽提............................................................. 8
5.一般樣品的分析...................................................................................................... 9
1]DNA定量測定................................................................................................ 9
2]電泳............................................................................................................... 10
3]PCR............................................................................................................... 10
6.抽提實例................................................................................................................ 10
7.疑難解答................................................................................................................ 11
注意事項
本試劑盒中所包含的所有試劑屬研究用試劑。請不要用于診斷或臨床等場合。在使用本試劑盒的時候,請嚴(yán)格遵守常用的實驗室安全操作程序。
Hoffman-La Roche Ltd.擁有PCR方法的專利權(quán)。
1.前言
MagExtractor-Plant Genome-利用在Chaotrpic(鹽)的情況下,DNA吸附于硅膠表面的特性,進(jìn)行plant DNA的抽提。本試劑盒與自動核酸抽提裝置MFX-2000并用,可簡便地從植物葉及植物培養(yǎng)細(xì)胞等植物樣品中抽提出高純度的plant DNA。另外,本試劑盒也可用作手動抽提用試劑盒而加以使用。
特征
·本試劑盒用于從植物標(biāo)本如培養(yǎng)細(xì)胞和葉子以及其它植物組織中進(jìn)行DNA抽提。
·無需進(jìn)行乙醇沉淀,可以實現(xiàn)快速抽提。
·不使用苯酚。
·不使用RNase。
·所抽提的DNA被回收到TE緩沖液中,可以被直接用于PCR或者其它分析方法。
2.使用前須知
·MagExtractor-Plant Genome-適用于以下樣品:
對應(yīng)樣品
|
樣品量
|
主要用途
|
植物標(biāo)本,如葉子以及培養(yǎng)細(xì)胞
|
0.01到0.1g
|
PCR
|
參見第十頁“6. 抽提實例”。
·有關(guān)溶解液的儲存
由于本試劑盒是在低溫下進(jìn)行儲存以及運輸,因此溶劑中的表面活性劑成分將有所沉淀。按照以下的步驟,請在室溫(20~30℃)下進(jìn)行相應(yīng)的溶解以及儲存。從溶劑的表面上看,有些情況下可能沒有任何沉淀出現(xiàn),但是,可能已形成了透明凝塊,故在使用之前,務(wù)必進(jìn)行以下操作。同樣,如果在儲存期間產(chǎn)生沉淀,也進(jìn)行相同的操作并進(jìn)行溶解。其它試劑請在4℃下進(jìn)行儲存。
(參照第2頁“[3] 試劑盒中包含的物品”。)
(1)在50℃的水浴下,加熱10分鐘。
(2)輕輕地上下轉(zhuǎn)動瓶子以溶解沉淀的凝塊。(劇烈搖動會形成泡沫。)
(3)在50℃的水浴下中,再次加熱5分鐘。
(4)輕輕地上下轉(zhuǎn)動瓶子以進(jìn)行完全溶解。
如果在溶液中仍然有一些未溶解的部分,則在水浴下中再次加熱5分鐘并上下轉(zhuǎn)動混合直到未溶解的部分完全被溶解。
(可能會形成透明凝塊,請進(jìn)行兩次檢查以確保完全溶解。)
·建議在室溫(20~30℃)下使用本試劑盒。低溫會導(dǎo)致溶劑成分的沉淀可能會影響
本試劑盒的性能。
·有關(guān)溶解液的儲存
由于本試劑盒是在低溫下進(jìn)行儲存以及運輸,因此溶劑中的表面活性劑成分將有所沉淀。按照以下的步驟,請在室溫(20~30℃)下進(jìn)行相應(yīng)的溶解以及儲存。從溶劑的表面上看,有些情況下可能沒有任何沉淀出現(xiàn),但是,可能已形成了透明凝塊,故在使用之前,務(wù)必進(jìn)行以下操作。同樣,如果在儲存期間產(chǎn)生沉淀,也進(jìn)行相同的操作并進(jìn)行溶解。其它試劑請在4℃下進(jìn)行儲存。
(參照第2頁“[3] 試劑盒中包含的物品”。)
(1)在50℃的水浴下,加熱10分鐘。
(2)輕輕地上下轉(zhuǎn)動瓶子以溶解沉淀的凝塊。(劇烈搖動會形成泡沫。)
(3)在50℃的水浴下中,再次加熱5分鐘。
(4)輕輕地上下轉(zhuǎn)動瓶子以進(jìn)行完全溶解。
如果在溶液中仍然有一些未溶解的部分,則在水浴下中再次加熱5分鐘并上下轉(zhuǎn)動混合直到未溶解的部分完全被溶解。
(可能會形成透明凝塊,請進(jìn)行兩次檢查以確保完全溶解。)
·建議在室溫(20~30℃)下使用本試劑盒。低溫會導(dǎo)致溶劑成分的沉淀可能會影響
本試劑盒的性能。
3.試劑盒中所包含的物品
在本試劑盒中含有可以抽提出100份RNA樣品的試劑。請在以下的溫度下儲存這些試劑:
在本試劑盒中含有可以抽提出100份RNA樣品的試劑。請在以下的溫度下儲存這些試劑:
試劑
|
容量
|
儲存
|
溶解液
|
40ml
|
溶解后,在室溫(20~30℃)下保存。
|
吸附液
|
90ml
|
4℃
|
洗凈液
|
200ml
|
4℃
|
磁珠
|
5ml
|
4℃
|
·分別以各自規(guī)定的溫度進(jìn)行保存,并且在使用之前請先將它們回復(fù)到室溫狀態(tài)。另外,也可以在室溫(25℃以下)下進(jìn)行(1個月內(nèi))短期儲存。
·吸附液以及洗凈液含有高濃度的蛋白質(zhì)變性劑。在處理時應(yīng)小心謹(jǐn)慎并戴上手套以及其它防護用具并且實施適當(dāng)?shù)陌踩A(yù)防措施。萬一試劑沾在手或者皮膚上,請用清水充分清洗。如若碰到眼睛,請立刻用清水清洗,然后去看醫(yī)生。
·如果使用本公司的MFX-2000自動核酸抽提裝置,請將所需的量倒入指定的試管中,并將其安裝在規(guī)定的位置上。
(參照第6頁“4 - [4] -(5)試劑的安裝”。)
4.操作程序
1]試劑盒需要的其他物品
(1)試劑
·液氮
·氯仿/異戊醇
將氯仿:異戊醇*1以比例24:1(體積比)混合
·滅菌水
市場上銷售的純水或者經(jīng)過高溫高壓蒸汽滅菌消毒處理過的milli Q水。
·乙醇
99.5%以上的特級品。用于手動抽提時,請使用70%的乙醇。
·TE緩沖液(pH 8.0)
10mM Tris-HCI(pH 8.0),lmM EDTA(pH 8.0)
*1又被稱為3-甲基-1-丁醇。
1]試劑盒需要的其他物品
(1)試劑
·液氮
·氯仿/異戊醇
將氯仿:異戊醇*1以比例24:1(體積比)混合
·滅菌水
市場上銷售的純水或者經(jīng)過高溫高壓蒸汽滅菌消毒處理過的milli Q水。
·乙醇
99.5%以上的特級品。用于手動抽提時,請使用70%的乙醇。
·TE緩沖液(pH 8.0)
10mM Tris-HCI(pH 8.0),lmM EDTA(pH 8.0)
*1又被稱為3-甲基-1-丁醇。
(2)器具及器材
·微量移液器
·微量移液器用tip
·(具有大約3,000到12,000 rpm的)臺式離心機
·加溫block(也可以是水浴槽,65℃)
·1.5ml微型試管
當(dāng)使用MFX-2000時:
·抽提專用試管(Code No.:MFX-301).......................................... 用于樣品回收
·抽提專用6連試管(Code No.:MFX-302)................................... 用于進(jìn)行抽提
·附帶專用過濾器的tip(Code No.:MFX-402)
·安裝試劑用試管(50ml、15ml、2ml)*1
2]抽提流程
經(jīng)簡單的前處理之后,MagExtractor -Plant Genome-可以使用MFX-2000進(jìn)行自動抽提。以下是關(guān)于抽提流程的說明。
經(jīng)簡單的前處理之后,MagExtractor -Plant Genome-可以使用MFX-2000進(jìn)行自動抽提。以下是關(guān)于抽提流程的說明。
使用液氮的凍結(jié)樣品
|
使用MFX-2000進(jìn)行抽提
|
←溶解液........................................................................................................ [細(xì)胞分解]
←在65℃下進(jìn)行10分鐘
←氯仿抽提.............................................................................................. [多聚糖的去除]
←吸附液 前處理約15分鐘
←磁珠:大約2分鐘................................................................................... [DNA的吸附]
B/F分離
←洗凈液:大約5秒(2次).......................................................... [非特異吸附物的去除]
B/F分離
←70%的乙醇:大約5秒(2次).................................................. [蛋白質(zhì)變性劑的去除]
B/F分離
←抽提液(TE):大約2分鐘...................................................................... [DNA的溶出]
B/F分離
上清液的回收(100 μl) 自動抽提總共耗時大約10到12分鐘
即使用當(dāng)手工方法進(jìn)行抽提,在前處理之后,DNA抽提也只需耗時約十五分鐘。(參照第八頁上的“[4]- 5使用手工方法進(jìn)行Plant DNA抽提”。)
3]樣品前處理
進(jìn)行DNA抽提時使用MagExtractor-Plant Genome-試劑盒進(jìn)行DNA抽提時要求對所使用的樣品進(jìn)行前處理。(參照第三頁上的“[4] –[2]抽提流程”。)
根據(jù)以下步驟,進(jìn)行前處理。
(1)將儲存在液氮中的0.01~0.1g的樣品磨碎。(快速進(jìn)行該項,并同時補充液氮以避免樣品融解。)
(2)將樣品移入1.5ml試管中。(使用液氮或者其它方法對使用的藥匙及試管進(jìn)行提前冷卻以避免已磨碎的樣品被融解。)
(3)在樣品中添加300μl的溶解液并進(jìn)行充分混合。(確認(rèn)其沒有沉淀后再進(jìn)行添加。如果有沉淀,請參照第一頁“2. 使用前須知”并對沉淀進(jìn)行溶解。)
(4)使用旋渦混合器,劇烈振動10秒鐘。(只有將樣品完全浸沒溶劑之后,才能進(jìn)行振動。)
(5)在65℃下培育10分鐘。(使用旋渦混合器,每隔3到4分鐘進(jìn)行共2次的劇烈攪拌,每次5秒鐘。)
(6)添加300μl的氯仿/異戊醇。
(7)劇烈混合3~5秒鐘。(旋渦混合器可能無法使溶液被完全均勻地混合,可用手劇烈搖動使其混合。)
(8)用離心機以12,000 rpm的速度進(jìn)行1分鐘的離心。(根據(jù)樣品的不同情況,可能會有少量的沉淀。如果發(fā)生了這種情況,請再用離心機進(jìn)行2~3分鐘的離心。)
(9)將250μl的上清液回收到一個未使用過的1.5ml試管中。(如果上清液少于250μl,則必須非常仔細(xì)地進(jìn)行操作,同時對溶液界面進(jìn)行抽吸以回收上清液。上清液的量因樣品而有所不同。
例: 0.1g的煙草大約有250μl
0.1g的水稻植物大約有200μl
(10)添加600μl的吸附液。
(如果上清液少于100μl,則添加750μl吸附液。)
進(jìn)行DNA抽提時使用MagExtractor-Plant Genome-試劑盒進(jìn)行DNA抽提時要求對所使用的樣品進(jìn)行前處理。(參照第三頁上的“[4] –[2]抽提流程”。)
根據(jù)以下步驟,進(jìn)行前處理。
(1)將儲存在液氮中的0.01~0.1g的樣品磨碎。(快速進(jìn)行該項,并同時補充液氮以避免樣品融解。)
(2)將樣品移入1.5ml試管中。(使用液氮或者其它方法對使用的藥匙及試管進(jìn)行提前冷卻以避免已磨碎的樣品被融解。)
(3)在樣品中添加300μl的溶解液并進(jìn)行充分混合。(確認(rèn)其沒有沉淀后再進(jìn)行添加。如果有沉淀,請參照第一頁“2. 使用前須知”并對沉淀進(jìn)行溶解。)
(4)使用旋渦混合器,劇烈振動10秒鐘。(只有將樣品完全浸沒溶劑之后,才能進(jìn)行振動。)
(5)在65℃下培育10分鐘。(使用旋渦混合器,每隔3到4分鐘進(jìn)行共2次的劇烈攪拌,每次5秒鐘。)
(6)添加300μl的氯仿/異戊醇。
(7)劇烈混合3~5秒鐘。(旋渦混合器可能無法使溶液被完全均勻地混合,可用手劇烈搖動使其混合。)
(8)用離心機以12,000 rpm的速度進(jìn)行1分鐘的離心。(根據(jù)樣品的不同情況,可能會有少量的沉淀。如果發(fā)生了這種情況,請再用離心機進(jìn)行2~3分鐘的離心。)
(9)將250μl的上清液回收到一個未使用過的1.5ml試管中。(如果上清液少于250μl,則必須非常仔細(xì)地進(jìn)行操作,同時對溶液界面進(jìn)行抽吸以回收上清液。上清液的量因樣品而有所不同。
例: 0.1g的煙草大約有250μl
0.1g的水稻植物大約有200μl
(10)添加600μl的吸附液。
(如果上清液少于100μl,則添加750μl吸附液。)
4]使用MFX-2000進(jìn)行Plant DNA抽提
在使用MFX-2000之前,請務(wù)必通讀完其使用說明書。
(1)操作程序的選擇
現(xiàn)在可供使用的MFX-2000程序可針對DNA、Total RNA、質(zhì)粒DNA等的抽提。使用MagExtractor-Plant Genome-請用第13號操作程序。
(2)加溫block以及回收block溫度的設(shè)定
將加溫block以及冷卻 block設(shè)定成如下所述的溫度:
加溫block 冷卻 block
溫度設(shè)定 OFF 10℃
在使用MFX-2000之前,請務(wù)必通讀完其使用說明書。
(1)操作程序的選擇
現(xiàn)在可供使用的MFX-2000程序可針對DNA、Total RNA、質(zhì)粒DNA等的抽提。使用MagExtractor-Plant Genome-請用第13號操作程序。
(2)加溫block以及回收block溫度的設(shè)定
將加溫block以及冷卻 block設(shè)定成如下所述的溫度:
加溫block 冷卻 block
溫度設(shè)定 OFF 10℃
·由于不使用加溫 block,請切斷其電源。
·使用簡易保冷block時,請將block事先置于冷藏庫或是低溫室進(jìn)行予冷。簡易保冷可用于回收液的臨時保冷。
·使用簡易保冷block時,請將block事先置于冷藏庫或是低溫室進(jìn)行予冷。簡易保冷可用于回收液的臨時保冷。
(3)附帶專用過濾器的tip安裝
將具有專用過濾器的tip安裝在tip架上。相關(guān)數(shù)量,請參見以下表格。
·請務(wù)必使用附帶專用過濾器的tip(Code No.:MFX-402)。
·tip已經(jīng)過γ射線消毒。在進(jìn)行安裝時,一定要使用手套。
·安裝超過規(guī)定數(shù)量的tip不會引起任何問題。
·將必要量的tip從左下方開始,垂直地排列在tip架上。有關(guān)安裝位置的更多細(xì)節(jié),請參見MFX-2000使用說明書。
將具有專用過濾器的tip安裝在tip架上。相關(guān)數(shù)量,請參見以下表格。
·請務(wù)必使用附帶專用過濾器的tip(Code No.:MFX-402)。
·tip已經(jīng)過γ射線消毒。在進(jìn)行安裝時,一定要使用手套。
·安裝超過規(guī)定數(shù)量的tip不會引起任何問題。
·將必要量的tip從左下方開始,垂直地排列在tip架上。有關(guān)安裝位置的更多細(xì)節(jié),請參見MFX-2000使用說明書。
樣品數(shù)
|
tip數(shù)
|
樣品數(shù)
|
tip數(shù)
|
1
|
6
|
13
|
39
|
2
|
8
|
14
|
41
|
3
|
10
|
15
|
43
|
4
|
12
|
16
|
45
|
5
|
17
|
17
|
50
|
6
|
19
|
18
|
52
|
7
|
21
|
19
|
54
|
8
|
23
|
20
|
56
|
9
|
28
|
21
|
61
|
10
|
30
|
22
|
63
|
11
|
32
|
23
|
65
|
12
|
34
|
24
|
67
|
(4)專用試管的安裝
根據(jù)樣品個數(shù),將專用試管(編號.:MFX-301)或者特制的6連試管(編號:MFX-302)安裝在抽提架的A到F的插槽以及回收block上。
·除了以上提及的專用試管,不得將其它試管安裝在抽提架中,否則容易產(chǎn)生故障。
·專用試管(編號:MFX-301)以及帶螺旋帽的1.5ml試管*1被設(shè)置在回收block中。
·有關(guān)設(shè)置位置的更多細(xì)節(jié),請參照MFX-2100使用說明書。
*Assist試管(編號:72.692)等
根據(jù)樣品個數(shù),將專用試管(編號.:MFX-301)或者特制的6連試管(編號:MFX-302)安裝在抽提架的A到F的插槽以及回收block上。
·除了以上提及的專用試管,不得將其它試管安裝在抽提架中,否則容易產(chǎn)生故障。
·專用試管(編號:MFX-301)以及帶螺旋帽的1.5ml試管*1被設(shè)置在回收block中。
·有關(guān)設(shè)置位置的更多細(xì)節(jié),請參照MFX-2100使用說明書。
*Assist試管(編號:72.692)等
(5)試劑的安裝
將試劑注入到規(guī)定的試管中并將它們安裝在指定的試劑架上。
·確認(rèn)每種試劑是否都已回復(fù)到室溫。
·試劑的必需量依據(jù)樣品的數(shù)量而定。請參照下頁的表格,安裝試劑。
·在進(jìn)行分裝之前,請充分地攪動磁珠并進(jìn)行確認(rèn),直到這些磁珠已均勻混合。然后將它們分裝到2ml試管中。另外,在注入磁珠后,請立刻(10分鐘之內(nèi))啟動儀器,否則會導(dǎo)致產(chǎn)物有很大的差異并有可能導(dǎo)致儀器發(fā)生故障。
·使用微量移液器分裝磁珠。對于其它試劑,則將試管上的刻度標(biāo)記作為分裝時的標(biāo)準(zhǔn)。
·抽提后所剩的試劑可以被再次使用。但是,如果長時間存放不用,則由于蒸發(fā)或者其它現(xiàn)象液體成分可能會發(fā)生變化。請務(wù)必注意。
·請注意本試劑盒并不包含滅菌水、乙醇(99.5%以上的特級品)以及TE緩沖液(pH8.0)。(參照第2頁上的“4 - [1] - (1)試劑”。)
安裝位置
|
試劑名
|
試管容量
|
1
|
滅菌水
|
50ml
|
2
|
洗凈液
|
50ml
|
5
|
乙醇
|
50ml
|
7
|
磁珠
|
2ml
|
9
|
TE緩沖液(pH8.0)
|
15ml
|
每種試劑的使用劑量
試劑
|
滅菌水
|
洗凈液
|
乙醇
|
磁珠
|
TE
|
試管容量
|
50ml
|
50ml
|
50ml
|
2ml
|
15ml
|
安裝位置
|
1
|
2
|
5
|
7
|
9
|
各試管中分裝的試劑量(ml)
樣品數(shù)
|
1
|
5
(20)
|
5
(20)
|
5
(20)
|
0.5
(1.5)
|
2
(5)
|
2
|
||||||
3
|
10
(20)
|
10
(20)
|
||||
4
|
||||||
5
|
15
(20)
|
0.8
(1.5)
|
||||
6
|
10
(20)
|
15
(20)
|
3
(5)
|
|||
7
|
||||||
8
|
20
(20)
|
|||||
9
|
||||||
10
|
20
(20)
|
|||||
11
|
25
(35)
|
|||||
12
|
||||||
13
|
1
(1.5)
|
|||||
14
|
30
(35)
|
25
(35)
|
||||
15
|
||||||
16
|
15
(20)
|
35
(35)
|
4
(5)
|
|||
17
|
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18
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30
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1.3
(1.5)
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(45)
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35
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23
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1.5
(1.5)
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24
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·上表中所示根據(jù)樣品總數(shù)而定的每種試劑分裝量的參考標(biāo)準(zhǔn)。這些數(shù)值都含有保留量,因此,請根據(jù)這些數(shù)值將試劑分裝到試管中。
·圓括號中的數(shù)值代表當(dāng)試劑分裝到試管中時的最大容許量標(biāo)準(zhǔn)。分裝量超過這些數(shù)值可能會造成噴嘴污染、引起溢出等其它問題。
(6)樣品的安裝
按照第4頁上的“4 – [3] 樣品前處理”來制備樣品,并把它們安裝在抽提架上。
·如果使用帶有螺旋帽的1.5ml樣品試管,則剪掉蓋子連結(jié)部后將它們放在樣品的安裝位置上。
·將它們按照順序安裝在編號1~24的插孔中。
(7)抽提開始
按照以下標(biāo)準(zhǔn),開始進(jìn)行抽提。
①確認(rèn)是否按照所規(guī)定的說明安裝了樣品、試管、專用試管(抽提架以及回收block)以及專用tip。
②確認(rèn)每個架子的安裝位置以及工作臺是否已完全收納到里面(直至聽到“咔喳”聲)。關(guān)上機器前門。(如果機器前門未完全關(guān)上,則抽提不會開始。)
③接通MFX-2000的電源。
④在液晶顯示屏上將出現(xiàn)“操作程序”以及“樣品數(shù)”。輸入操作程序“13”并且在“樣品數(shù)”中輸入樣品數(shù)量的數(shù)值。
⑤屏幕上會顯示提示“請按下啟動鍵”,后按下“START”。
⑥抽提啟動后液晶顯示屏上會顯示“操作中”。
(8)樣品的回收
在完成抽提后,打開機器前門并取出樣品。
·在完成抽提后,所抽提的DNA將回收到安裝在回收block上的試管中。在液晶顯示屏上也將再次出現(xiàn)“請按下啟動鍵”。
·在已經(jīng)證實了儀器已完全停止運轉(zhuǎn)之后,從回收block中取出試管并在冷藏或者在低溫(4~10℃)下儲存直到再次使用這些試管。
·從磁珠中溶出的DNA,由于使用的是大約100μl的溶出液(TE緩沖液),因此回收液也為100μl左右。
按照第4頁上的“4 – [3] 樣品前處理”來制備樣品,并把它們安裝在抽提架上。
·如果使用帶有螺旋帽的1.5ml樣品試管,則剪掉蓋子連結(jié)部后將它們放在樣品的安裝位置上。
·將它們按照順序安裝在編號1~24的插孔中。
(7)抽提開始
按照以下標(biāo)準(zhǔn),開始進(jìn)行抽提。
①確認(rèn)是否按照所規(guī)定的說明安裝了樣品、試管、專用試管(抽提架以及回收block)以及專用tip。
②確認(rèn)每個架子的安裝位置以及工作臺是否已完全收納到里面(直至聽到“咔喳”聲)。關(guān)上機器前門。(如果機器前門未完全關(guān)上,則抽提不會開始。)
③接通MFX-2000的電源。
④在液晶顯示屏上將出現(xiàn)“操作程序”以及“樣品數(shù)”。輸入操作程序“13”并且在“樣品數(shù)”中輸入樣品數(shù)量的數(shù)值。
⑤屏幕上會顯示提示“請按下啟動鍵”,后按下“START”。
⑥抽提啟動后液晶顯示屏上會顯示“操作中”。
(8)樣品的回收
在完成抽提后,打開機器前門并取出樣品。
·在完成抽提后,所抽提的DNA將回收到安裝在回收block上的試管中。在液晶顯示屏上也將再次出現(xiàn)“請按下啟動鍵”。
·在已經(jīng)證實了儀器已完全停止運轉(zhuǎn)之后,從回收block中取出試管并在冷藏或者在低溫(4~10℃)下儲存直到再次使用這些試管。
·從磁珠中溶出的DNA,由于使用的是大約100μl的溶出液(TE緩沖液),因此回收液也為100μl左右。
5]使用手動法進(jìn)行Plant DNA抽提
本試劑盒也可以用于手工DNA抽提?砂凑找韵虏襟E進(jìn)行抽提。
·對于磁珠分離,建議使用市場上銷售的1.5ml微型試管用磁性臺架。另外,使用臺式離心機以3,000 rpm 程度離心15秒鐘也能夠進(jìn)行分離。
·未包含在本試劑盒中的其它必需物品
請參照第2頁“4 – [1] – (1)試劑”。
請事先制備將特級乙醇與滅菌水按7:3比例混合的70%乙醇溶液。(每個樣品需要大約2ml。)
本試劑盒也可以用于手工DNA抽提?砂凑找韵虏襟E進(jìn)行抽提。
·對于磁珠分離,建議使用市場上銷售的1.5ml微型試管用磁性臺架。另外,使用臺式離心機以3,000 rpm 程度離心15秒鐘也能夠進(jìn)行分離。
·未包含在本試劑盒中的其它必需物品
請參照第2頁“4 – [1] – (1)試劑”。
請事先制備將特級乙醇與滅菌水按7:3比例混合的70%乙醇溶液。(每個樣品需要大約2ml。)
①取出按照第4頁“4 – [3] 樣品前處理”制備的樣品。
②添加40μl磁珠。(在使用之前請將磁珠進(jìn)行充分的混合。)
③使用試管混合器來進(jìn)行1分鐘的劇烈混合。[DNA的吸收]
④將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。(此時,對這些磁珠進(jìn)行數(shù)次顛倒混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。)
⑤去除上清液。
⑥添加900μl洗凈液。
⑦使用旋渦混合器劇烈混合5秒鐘。(此時,確認(rèn)磁珠是否已被充分地分散以及混合。)
⑧將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。(此時,對這些磁珠進(jìn)行數(shù)次顛倒混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。)
⑨去除上層清液。
⑩重復(fù)步驟⑥~⑨。
⑾添加900μl的70%乙醇溶液。
⑿使用旋渦混合器劇烈混合5秒鐘。(此時,確認(rèn)磁珠是否已被充分地分散以及混合。)
⒀將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。(此時,對這些磁珠進(jìn)行數(shù)次混合并且盡可能多地回收粘在蓋子上的磁珠。)
⒁去除上清液。
⒂重復(fù)步驟⑾~⒁。(盡可能多地去除包括乙醇在內(nèi)的任何殘留在蓋子上的物質(zhì)。)
⒃添加100μl TE緩沖液。
⒄使用試管混合器劇烈混合1分鐘。[DNA的溶出]
⒅將試管安裝在磁性臺架上并放置30秒左右以使磁珠凝集。
⒆將含有DNA的上清液回收到一個未用過的1.5ml微型試管中。
5.一般樣品的分析
請按照以下注意事項進(jìn)行操作。
1]DNA定量
·當(dāng)用吸收度檢測法進(jìn)行DNA定量測定時,請務(wù)必用離心機分離所回收的溶液(12,000 rpm, 1分鐘)并使用上清液。
·當(dāng)計算A260nm/A280nm比例以及DNA濃度時,請務(wù)必用A320nm數(shù)值進(jìn)行校正。
請按照以下注意事項進(jìn)行操作。
1]DNA定量
·當(dāng)用吸收度檢測法進(jìn)行DNA定量測定時,請務(wù)必用離心機分離所回收的溶液(12,000 rpm, 1分鐘)并使用上清液。
·當(dāng)計算A260nm/A280nm比例以及DNA濃度時,請務(wù)必用A320nm數(shù)值進(jìn)行校正。
DNA濃度
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(A260-A320) x 50μg/ml
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A260nm/A280nm
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(A260-A320) /(A280-A320)
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2]電泳
·若將一部分回收液直接用于電泳,請將Loading Dye的量增加為通常的1.5到2倍,否則可能會發(fā)生樣品無法沉入樣品孔中,使得電泳失效。
3]PCR
·回收液中混有大約10%的乙醇溶液。如果直接用于PCR,可能會阻礙反應(yīng)的進(jìn)行。因此,不要超過反應(yīng)總液的五分之一(即:在每50μl的反應(yīng)液中最多可有10μl)。
·可能會在所回收的溶液中混入了少量的磁珠。但這并不會阻礙PCR。
6.抽提實例
以下是使用MFX-2000從0.1g樣品中進(jìn)行抽提的實例。
以下是使用MFX-2000從0.1g樣品中進(jìn)行抽提的實例。
樣品
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回收量
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煙草(葉子)
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3~5μg
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煙草(培養(yǎng)細(xì)胞)
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2~3μg
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水稻植物(葉子)
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3~5μg
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Arabidopsis thaliana(葉子)
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1μg
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番茄(葉子)
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3μg
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卷心菜(葉子)
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3μg
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玉米(葉子)
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3~4μg
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·回收量根據(jù)不同的樣品類型以及條件而會有所變動。請以本書中所述的數(shù)值作為標(biāo)準(zhǔn)。
7.疑難解答
產(chǎn)生錯誤時,請參照以下對策。
1]回收量低,無法得到DNA
產(chǎn)生錯誤時,請參照以下對策。
1]回收量低,無法得到DNA
原因
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對策
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樣品過剩
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即使使用規(guī)定量以上的樣品,也不會使回收量上升,反而會使效率下降。請減少樣品量。另外,有的樣品單位重量下體積可能會很大。如果無法浸沒在溶解液中,則也請減少樣品量。
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破碎不充分
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液氮下的凍結(jié)粉碎不充分是一個原因。進(jìn)行充分的破碎處理直到它成為細(xì)粉末。并請注意破碎時不要使樣品解凍。
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溶解不充分
(1)氯仿抽提液為250μl左右的情況
(2)氯仿抽提液低于150μl或者非常少的情況
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可能是溶解液與樣品之間混合不充分,或者樣品本身難以溶解所致。將溶解液與樣品進(jìn)行充分混合,使用旋渦混合器振動1分鐘后再進(jìn)行抽提。(通常為10秒鐘)
可能是樣品內(nèi)水份含量較少而吸收了部分溶解液。請?zhí)砑尤芙庖褐?/span>350~400μl并按照以上(1)的對策繼續(xù)進(jìn)行抽提,即可獲得良好效果。
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試劑量不足
(MFX抽提)
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確認(rèn)試劑量是否不足或者檢查殘留物的數(shù)量。如果幾乎沒有任何殘留物(200μl以下),說明試劑量不足。
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吸附,溶出不充分
(手動抽提)
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使用手動法時,通過使用試管混合器攪動1分鐘來使磁珠吸收DNA以及從磁珠中分離出DNA。(參照第9頁“5 - [5] 手動抽提法”(3),(17))。各攪拌10分鐘左右,則DNA回收量將會增加。
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·回收量可能視樣品的類型以及儲存條件而有所不同。
2]在氯仿抽提過程中無法良好分離
原因
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對策
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在添加了氯仿以及異戊醇之后的混合不充分
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使用旋渦混合器時可能會無法達(dá)到充分的混合?捎檬稚舷聞×业?fù)u動樣品使其混合,然后用離心機進(jìn)行分離。
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3]PCR 不能有效進(jìn)行
原因
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對策
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回收液中混入的乙醇溶液產(chǎn)生了阻礙作用
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如果使用超過反應(yīng)液容積五分之一的量,則可能會抑制反應(yīng)的發(fā)生。在這種情況下,減少所使用的溶液量。同樣地,可以通過在75℃下加熱所回收的溶液5分鐘來提高效果。
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· 其他關(guān)于PCR的疑難解答,請參考本公司的各種PCR用酶的實例集或者其他PCR相關(guān)解說書等。
4]在洗凈時,磁珠未完全散開(磁珠粘在tip上)
原因
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對策
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樣品過剩
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如果試劑量過多,磁珠可能會凝結(jié)。如果使用高于規(guī)定值的樣品量,回收量不會增加,反而會有所下降。請減少樣品量。
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試劑量不足
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確認(rèn)試劑量是否不足或者檢查殘留物量。如果幾乎沒有任何殘留物(200μl以下),則說明試劑量不足。洗凈液如果不足會導(dǎo)致混合不充分并且磁珠不會完全散開。
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5]磁珠未能很好地分裝
原因
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對策
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由于磁珠的沉淀而導(dǎo)致凝固
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使用旋渦混合器,使溶液混合直至均勻之后,該溶液可以被再次用于進(jìn)行抽提。在開始抽提之前,使用旋渦混合器進(jìn)行混合直至均勻,或者在開始之前(10分鐘之內(nèi)),將磁珠放入一個2ml試管中。
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由于蒸發(fā)而引起的混合液成分的濃縮以及結(jié)晶化
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為了避免發(fā)生這種問題,請不要再使用殘留在2ml試管中的磁珠。即使只是短時間內(nèi)儲存或者不使用,也要完全蓋上瓶子或者試管的蓋子。
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·關(guān)于儀器操作的疑難解答,在MFX-2000的使用說明書中另有說明,請加以參考。