一、用途
HKM®鏈球菌乳膠試劑盒用于對選擇性平板上分離出的可疑鏈球菌以Lancefield方法進行A、B、C、D、F和G分群。
從感染鏈球菌病人分離出的大部分鏈球菌具有特異性血清群抗原。鑒定這些菌株包括從培養(yǎng)物中提取和鑒定這些特異性抗原。鏈球菌分群系統(tǒng)試劑盒內(nèi)有可快速提取碳水化合物抗原的酶試劑和可快速鑒定提取出的A、B、C、D、F和G特異抗原的系列乳膠試劑。
該試劑盒僅供專業(yè)人員使用。
二、原理
試劑盒內(nèi)乳膠試劑顆粒表面包被與鏈球菌A、B、C、D、F或G群碳水化合物抗原分別具有特異性的兔抗體。
從平板上分離的可疑鏈球菌菌落經(jīng)酶試劑培養(yǎng)以提取抗原,提取出的抗原在檢測板用6種分別含有一種A、B、C、D、F或G特異性抗體的乳膠試劑懸液測試,如果存在某抗原,其對應(yīng)的乳膠顆粒會凝集,而其它乳膠試劑則保持光滑狀態(tài)。
三、試劑盒組成成分
每個試劑盒內(nèi)含50次測試的試劑,試劑瓶標(biāo)簽上標(biāo)有每種試劑的失效期。
HM
含有包被鏈球菌A群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。
HM47b REAG B 試劑B 2.5mL
含有包被鏈球菌B群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。
HM
含有包被鏈球菌C群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。
HM47d REAG D 試劑D 2.5mL
含有包被鏈球菌D群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。
HM
含有包被鏈球菌F群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。
HM
含有包被鏈球菌G群的兔抗體乳膠顆粒及穩(wěn)定劑和0.099%疊氮化鈉防腐劑的緩沖液。
HM47pCONTROL + 陽性對照試劑 1.0mL
含有無活性的鏈球菌A、B、C、D、F和G多價抗原提取物和0.099%的疊氮化鈉防腐劑。
HM47x ENZ 酶試劑 2×10mL
凍干的酶提取試劑
使用說明書
檢測板
攪拌棒
需要的其它材料
l 接種環(huán)
l 塑料或玻璃試管
l 可分裝0.4mL容積的移液器
l
l 樣品滴管或移液管
l 實驗室計時器
四、警告和注意事項
1、試劑僅供體外診斷使用。
2、不要使用過期產(chǎn)品。
3、不要造成試劑或樣品的交叉污染。
4、按說明書使用試劑盒。
5、不要用嘴吸取試劑或樣品。
6、所有臨床樣品及其培養(yǎng)物均應(yīng)遵循按潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序。被污染的物品可用3%的次氯酸鈉消毒處理30分鐘。含酸的廢液應(yīng)作中和處理。
7、試劑盒內(nèi)作防腐劑使用的0.099%疊氮化鈉應(yīng)小心處理,疊氮化鈉可與鉛或銅制品反應(yīng)形成易爆的金屬疊氮化物。可用大量水沖洗以避免疊氮化物的堆積。
五、貯存
檢測試劑盒不使用時應(yīng)貯存在2~8℃,不要凍存。在這種條件下,可保證包裝盒內(nèi)的產(chǎn)品在有效期內(nèi)的有效性。
試劑盒內(nèi)酶提取試劑在加水溶解后,2~8℃保存時,可使用3個月。如需延長保存期,可在溶解后每支試管分裝0.4mL,在-20℃或更低的溫度下凍存可使用6個月。酶試劑不可重復(fù)解凍和凍存。
顯示變質(zhì)的跡象
出現(xiàn)下列情況時,產(chǎn)品可能失效:
l 乳膠試劑出現(xiàn)明顯結(jié)塊,并且強烈搖動幾秒鐘后無法消除。
l 陽性對照試劑或酶試劑出現(xiàn)絮狀或沉淀
l 在規(guī)定時間內(nèi),陽性對照試劑與1個或幾個乳膠試劑反應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。
l 未接種的酶試劑與乳膠試劑出現(xiàn)凝集反應(yīng)。
不要使用發(fā)生變質(zhì)跡象的產(chǎn)品。
六、樣品及其準(zhǔn)備
試劑盒用于檢測在培養(yǎng)基上經(jīng)過夜培養(yǎng)的可疑鏈球菌菌落。對于樣品收集及處理、接種及培養(yǎng)用的培養(yǎng)基可參考相關(guān)資料。檢測的可疑菌落可選取平板上初步分離的培養(yǎng)物或再次轉(zhuǎn)接的新鮮純培養(yǎng)物。不可直接檢測保存的菌株。溶血特性是鑒定分析中的一個重要特征,是否作溶血性鑒定分析取決于檢測的可疑菌落是否來自血基礎(chǔ)培養(yǎng)。
七、檢測過程
質(zhì)量控制:
應(yīng)定期作陽性對照測試,以確證檢測試劑的有效性。
在測試過程中,應(yīng)準(zhǔn)備好陽性對照試劑,并代替用酶試劑制成的菌懸液進行測試。陽性對照試劑應(yīng)與所有的乳膠試劑形成凝集反應(yīng)。如果未出現(xiàn)凝集表明試劑失效。
如果需要作陰性對照檢測,可用不加培養(yǎng)物的酶試劑代替用酶試劑制成的菌懸液進行測試。
測試程序:
1、所有試劑在使用前應(yīng)達到室溫。
2、在使用前,加10mL蒸餾水溶解酶試劑。輕輕搖動,以溶解均勻。每個試管中分裝0.4mL酶提取液。
3、用接種環(huán)從平板中挑取可疑的鏈球菌菌落加入酶溶液中,制成菌懸液。為保證檢測結(jié)果,至少應(yīng)取4-5個常規(guī)大小的菌落或相當(dāng)?shù)慕臃N量。酶溶液中接種量過多時,可引起非特異性凝集(如
4、將試管置
5、在使用前,搖動乳膠試劑以形成均勻的懸浮液。然后將各種已搖勻的乳膠試劑分別各滴1滴在6個不同的反應(yīng)環(huán)內(nèi)。
6、分別在6個已滴加乳膠試劑的反應(yīng)環(huán)內(nèi)滴加1滴酶提取液(或陽性對照試劑,見“對照”部分)
7、分別用不同的攪拌棒混勻反應(yīng)環(huán)內(nèi)的2滴試劑,并在整個反應(yīng)環(huán)內(nèi)涂布均勻。不要用同1支攪拌棒混勻不同反應(yīng)環(huán)內(nèi)的溶液。
8、輕輕搖動檢測板1分鐘上,以充分混合環(huán)內(nèi)的溶液。
9、觀察并記錄凝集結(jié)果,如果存在鏈球菌,應(yīng)會形成肉眼可見的明顯凝集。
八、結(jié)果判斷
在1分鐘的反應(yīng)時間內(nèi),如果形成肉眼可見的凝集,表明菌懸液是陽性。如果提取物中抗原濃度較高,可快速形成大塊凝集顆粒,如果菌懸液提取物中抗原濃度較低,凝集所需時間較長,凝集的顆粒會較小。但陽性和陰性反應(yīng)結(jié)果區(qū)別依然較明顯。
如果乳膠試劑保持原來的光滑乳狀,無明顯凝集,說明菌懸液是陰性。如果有不明顯的微弱凝集,應(yīng)忽略,判斷為陰性。
預(yù)期結(jié)果
β-溶血的菌落:
1、單個乳膠試劑凝集表明該菌株鑒定為相應(yīng)的血清群。
以下情況應(yīng)考慮增加其它的驗證試驗:
l 對于D群菌株,應(yīng)做生化鑒定分析以區(qū)分D群鏈球菌菌株與D群腸球菌(其對抗生素有較高的抗性)。
l 對于菌落微小的A、C或G群菌株,應(yīng)做生化鑒定以證實為S.milleri或咽峽炎鏈球菌。
2、多個乳膠試劑凝集,表明不同群的多個菌落混合生長,或單一菌株有多個群的抗原(如D群鏈球菌同時含有G群抗原)。可以進一步考慮下列實驗:
l 進一步分離培養(yǎng)以獲得純菌落重新進行測試。
l 同時含有D群和G群抗原的菌株應(yīng)進一步做生化鑒定以區(qū)分腸球菌與D群鏈球菌菌株(含兩種抗原的腸球菌可能比只含有D抗原的菌株對抗生素抗性更強)。
3、所有乳膠試劑均凝集,可能是加入酶溶液中的接種物過多,或測試的培養(yǎng)物有污染菌株引起非特異性凝集,(一般情況下,可以通過識別菌落特征以確認(rèn))。可以進一步考慮下列實驗:
l 使剩余的酶提取物沸騰2~3分鐘上,冷卻后進行重新測試,可能得到清晰的結(jié)果。
l 減少酶溶液中的接種物,重新測試。
l 進一步分離培養(yǎng),獲得純菌落重新進行測試。
4、乳膠試劑均無明顯凝集,測試樣品中可能無A、B、C、D、F或G群鏈球菌存在,或存在的數(shù)量低于檢測限。可以進一步考慮下列實驗:
l 使用較多接種物重新進行測試,特別在懷疑是鏈球菌D群或F群的情況時。
l 未得到分群結(jié)果的β-溶血鏈球菌,必要時用生化實驗進行鑒定分析。
非β-溶血的菌落:
如果出現(xiàn)單一的乳膠凝集結(jié)果顯示為B群或D群,可較好的表明菌株所鑒定的結(jié)果。如果結(jié)果顯示為A、C、F或G群,則不能說明菌株為所鑒定的結(jié)果,應(yīng)采用其它鑒定方法。
可以考慮增加以下程序:
l 如果結(jié)果顯示為D群,應(yīng)做進一步的生化鑒定以區(qū)分腸球菌與D群鏈球菌。
其它相關(guān)結(jié)果應(yīng)參考以上信息進行判斷。
九、使用的局限性
結(jié)果應(yīng)依據(jù)所有的臨床或?qū)嶒炇倚畔⑦M行判斷。精確的結(jié)果依賴于適當(dāng)?shù)木隄舛取E紶柨赡軙嬖谙铝星闆r:部分D群菌株的特征性抗原含量低或較微量。某些F群菌株較難從平板表面挑起,瓊脂培養(yǎng)基上添加0.51%~1%的葡萄糖可促進D群抗原的產(chǎn)生。添加葡萄糖會影響溶血現(xiàn)象的觀察。但當(dāng)血清群的鑒定非常重要時值得考慮添加葡萄糖。
菌落較小的菌株培養(yǎng)時增加二氧化碳的含量可促進生長。
鏈球菌Q、R和S群可能也含有可檢測水平的D群抗原。
據(jù)報道,某些不相關(guān)的屬種含有類似于鏈球菌各群的抗原。例如埃希氏菌、克雷伯氏菌和假單胞菌可引起假陽性結(jié)果。通常情況下,這些菌株可從菌落形態(tài)上加以區(qū)別,不會造成鑒定時的混淆。
十、檢測效果對比
HKM®鏈球菌乳膠試劑盒與一種已廣泛使用的商業(yè)化的乳膠試劑盒檢測效果對比,用二種產(chǎn)品檢測各獨立地點的臨床樣品。綜合結(jié)果如表1。
|
HKM® |
總計 |
||
陽性 |
陰性 |
|||
另一廣泛使用的乳膠試劑盒 |
陽性 |
607 |
55 |
662 |
陰性 |
0 |
24 |
24 |
|
總計 |
607 |
79 |
686 |
靈敏度 607/662=92%
特異性 24/24=100%
十一、重復(fù)性
批內(nèi)重復(fù)性:通過以系列稀釋度的參照抗原和試劑盒對照抗原對同1批產(chǎn)品的靈敏度進行檢測。由不同的操作者隨機測試3次,最終效價由參考/對照抗原測定,并且3次定性分析結(jié)果完全一致。
批間的重復(fù)性:通過以系列稀釋度的參照抗原對10批產(chǎn)品的靈敏度和特異性進行檢測。批次間,最終效價無差異及定性分析結(jié)果為100%一致性。廣東環(huán)凱微生物科技有限公司 電話:020-32077703