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1 簡介
本產(chǎn)品是用競爭酶聯(lián)免疫反應原理來檢測生物樣本中的氯霉素含量。本試劑盒包含檢測所需的所有試劑——包括標準品。
檢測數(shù)量：96孔（包括標準品）
檢測時間：20分鐘
2 應用范圍
本試劑盒可用于檢測奶、組織（肌肉、肝臟、腎臟、蝦類、蟹類、魚類）、尿液、血液和飼料樣本中的氯霉素。
3 原理
反應在包被了氯霉素抗體的固相微孔板上進行。標準品、樣品和酶標物加入到微孔中，第一次溫浴時，標準品或樣品中的游離氯霉素分子與酶標記的氯霉素分子競爭結(jié)合吸附在固相上的抗體結(jié)合位點。沒有結(jié)合的分子被清洗除去，通過加入顯色底物來確定已經(jīng)結(jié)合的酶的活性，酶使得無色的底物轉(zhuǎn)變成蘭色，加入反應終止液使得蘭色變?yōu)辄S色，用酶標儀在450nm處讀出吸光度。顏色的深淺可以轉(zhuǎn)換為樣品中氯霉素的不同濃度。
4 試劑組成
微孔板：96孔（12×8，可分拆）直接包被氯霉素抗體
標準品：0.025ng/mL; 0.1ng/mL; 0.25ng/mL; 1ng/mL; 4ng/mL; 1ml含0.1ug/ml濃度的氯霉素標準品1瓶
酶標物凍干粉：玻璃瓶 1瓶
酶標物稀釋液：13ml塑料瓶1瓶（棕色）
顯色劑：13ml 塑料瓶1瓶（棕色）
終止液：13ml塑料瓶1瓶（白色）
清洗液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）
氯霉素樣品稀釋液10×：50ml塑料瓶1瓶（白色）
5 需要但未提供的材料
樣品前處理需要：
－ 甲醇、乙酸乙酯、正己烷、異辛烷、三氯甲烷
－ 組織勻漿機、天平、水浴鍋，搖床（振蕩器）
－ 離心機，氮吹儀，混合振蕩器
檢測中需要：
－ 20～200ul移液槍和槍頭
－ 50～200ul多通道移液槍和槍頭
－ 配備450nm濾光片的酶標儀
－ 擠瓶
6 注意事項
－ 終止液含有硫酸，注意不要接觸皮膚
－ 顯色劑有毒，不要接觸皮膚；如果接觸請用水沖洗
－ 不要在有效期過后使用試劑
－ 不同批號的試劑不要混用
7 保存
－ 2～8℃保存，切勿冰凍
－ 沒有使用的微孔條請務必用干燥劑保存在密封的袋子中
8 樣品前處理
8.1尿樣
8.1.1直接法
— 200µl尿樣與800µl氯霉素樣品稀釋液混合
— 混合物在2000g，離心10min
— 取50µl上清用于檢測
— 檢測最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)5
8.1.2抽提法
建議對“深色/不潔”尿樣采用
— 1ml尿液用1M乙酸調(diào)PH值到4.8
— 加入25µl蝸牛液（Helix pomatia juice），37℃下溫浴過夜或55℃下溫浴2小時。
— 冷卻至室溫，并將PH值調(diào)節(jié)到7±0.5
— 加入2ml乙酸乙酯，混合1min。靜置5-10 min分層。
— 將1ml上層液（乙酸乙酯層）轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。
— 50℃，氮吹儀吹干
— 用200氯霉素樣品稀釋液溶解，混勻
— 取50µl用于檢測
— 檢測最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)0.4
8.2 血清/血漿樣品
— 1ml血清/血漿加入2ml乙酸乙酯混合1min，靜置5-10min，令其發(fā)生相分離
— 取1ml乙酸乙酯于一新的試管
— 50℃，氮吹儀吹干
— 加入500µl氯霉素樣品稀釋液混合均勻
— 取50µl用于檢測
— 檢測最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)1
8.3 奶
8.3.1
— 2000g，離心15min，去除上層脂肪
— 取50ul用于檢測。
注意：檢測酸奶時，應調(diào)樣品PH值至中性。
8.3.2
— 取5ml牛奶樣品于一試管中
— 2000g，離心15min，去除上層脂肪
— 取2.5ml脫脂奶于一新的試管
— 加入5ml乙酸乙酯，渦旋混合1min，靜置10min
— 取4ml乙酸乙酯上層到干凈玻璃管中
— 50℃，氮吹儀吹干
— 用200µl氯霉素樣品稀釋液溶解
— 取50µl用于檢測
— 計算最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)0.1
（脫脂奶粉處理方法：將60ml蒸餾水加入10g脫脂奶粉，再按上述步驟操作）
8.4蛋類樣品
— 取1g勻漿全蛋
— 加入6ml乙酸乙酯渦旋混合1min
— 2000g離心10min
— 取3ml上層乙酸乙酯于一新的試管
— 50℃，氮吹儀吹干
— 加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入500µl氯霉素樣品稀釋液，渦旋混合1min
— 2000g，離心10min
— 取50µl上層用于檢測
— 計算最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)1
注意：若上層乳化，可將試管置于80℃水浴約5min，并再次進行離心。
8.5 組織樣品（肉類、肝臟、蝦類、蟹類、魚類）
方法一：
— 取3g勻漿樣品
— 加入6ml乙酸乙酯渦旋混合，振搖10min
— 2000g，離心10min
— 取4ml乙酸乙酯上層于一新的試管
— 50℃，氮吹儀吹干
— 加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），再加入1ml氯霉素樣品稀釋液，渦旋混合1min
— 2000g，離心10min
— 吸取50µl上層用于檢測。
— 計算最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)0.5
注意：若上層乳化，可將試管置于水浴（80℃ ）約5min，并再次進行離心。
另：可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，離心后應完全去除上層正己烷，移取50µl下層用于檢測。
方法二：用于蝦、魚、蟹類的大樣品量處理
— 10g勻漿化樣品與20ml乙酸乙酯混合10min
— 2000g，離心10min（或用濾紙過濾）
— 取10ml乙酸乙酯層于一新的試管
— 50℃，氮吹儀吹干
— 加入2ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或2ml正己烷，參見方法一），并加入1ml氯霉素樣品稀釋液，充分混合。若發(fā)現(xiàn)乳化，可將試管在水�。�80℃）中加熱（5min）。并將此溶液在2000g下離心10min。
— 利用巴斯德滴管轉(zhuǎn)移上層清夜（若用正己烷，清夜則在下層）于清潔玻璃管中。
— 再加入1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V）（或1ml正己烷）�；旌仙鲜鋈芤翰㈦x心分離如上。
— 吸取50µl上層用于檢測（若用正己烷，清液則在下層）。
注：檢測最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)0.2
8.6 蜂產(chǎn)品
8.6.1蜂蜜樣品
— 3g樣品與3ml蒸餾水充分混合
— 加入6ml乙酸乙酯充分振蕩混合10min
— 2000g離心10min
— 轉(zhuǎn)移4ml上層乙酸乙酯于一新的試管
— 50℃，氮吹儀吹干
— 殘留物充分溶解于1ml氯霉素樣品稀釋液
— 吸取50µl用于檢測
對于不純凈的蜂蜜應進行脫脂處理：
— 將氮流蒸發(fā)后的殘留物溶于1ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），加入1ml樣品稀釋液
— 渦旋混合1min，2000g，離心10min
注意：若上層乳化，可將試管置于水浴（80℃）約5min，并再次進行離心。
— 吸取50µl上層用于檢測。
— 檢測最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)0.5。
另：可以用正己烷代替異辛烷/三氯甲烷。若采用正己烷，離心后應完全去除上層正己烷層，移取50µl下層用于檢測。
8.6.2蜂王漿
— 1g蜂王漿與4ml抽提緩沖液（10.1g 1-庚烷磺酸，11.4g Na3PO4.12H2O。溶于1000ml蒸餾水中，用H3PO4調(diào)整pH2.0）混合30min
— 3000g離心10min
— 取2.5ml上清液用Oasis HLB柱（60mg Waters公司W(wǎng)AT094226）按以下固相抽提步驟純化：
— 依次用1ml100％甲醇和1ml蒸餾水活化該柱（樣品過柱前柱不能過干，否則需要重復活化）
— 將上述2.5ml上清液真空抽濾過柱
— 用3ml蒸餾水及3ml 50％（1：1；V：V）甲醇洗柱，真空干柱
— 用1ml100％甲醇洗脫，用干凈玻璃管收集洗脫液
— 洗脫液在溫和氮流下蒸發(fā)甲醇
— 樣品殘留物溶入0.5ml氯霉素樣品稀釋液中
— 吸取50µl用于檢測
— 檢測最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)1
注意：若無真空泵，可使用正壓洗滌柱子；
流速均設定為1ml/min。
8.7 飼料樣品
— 5g樣品與20ml蒸餾水混勻
— 取5ml混合物到干凈玻管中，加入10ml乙酸乙酯混合2min
— 2000g離心10min
— 轉(zhuǎn)移5ml乙酸乙酯（上層）到干凈玻管中，50℃溫和的氮流下蒸發(fā)
— 殘留物溶于0.5ml異辛烷/三氯甲烷（2：3，V/V），加入0.5ml氯霉素樣品稀釋液，混合液渦旋1min，
— 2000g離心10min
— 取50µl上層用于檢測
— 檢測最終結(jié)果應乘以稀釋倍數(shù)1
注：若發(fā)現(xiàn)乳化，可將試管在水浴（80℃）中加熱（5min），并將此溶液再次離心，吸取50µl上層清液檢測
注意：本說明書提供的樣品前處理方法僅作參考，實驗人員可以根據(jù)自己的經(jīng)驗作改善以提高檢測準確度。
9 工作液準備
為了避免污染，建議在配置標準品不要與試劑檢測工作在同一室內(nèi)進行，并使用不同的移液槍。
注意：整套標準品應該在每個檢測實驗前臨時配置！！
氯霉素樣品稀釋液：用蒸餾水10倍稀釋（1＋9），注意：如果出現(xiàn)結(jié)晶，請將溶液放于室溫下?lián)u動，重新完全溶解。
標準品配制：使用已經(jīng)稀釋的氯霉素樣品稀釋液。
- 10ng/ml濃度：100ng/ml原始濃度溶液100ul +稀釋液900ul（1:10）
- 4ng/ml濃度：10ng/ml溶液400ul +稀釋液600ul（1:2.5）
- 1ng/ml濃度：4ng/ml 溶液 200ul +稀釋液600ul（1:4）
- 0.25ng/ml濃度：1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul（1:4）
- 0.1ng/ml濃度：0.25ng/ml溶液400ul+稀釋液600ul（1:2.5）
- 0.025ng/ml濃度：0.1ng/ml溶液200ul+稀釋液600ul（1:4）
此氯霉素樣品稀釋液也應當用于B0孔。
酶標物：實驗前用12mL酶標物稀釋液溶解，并充分混勻。靜置8小時（或過夜，但至少4小時），切勿渦旋混勻。
清洗液：用蒸餾水10倍稀釋（1＋9）。注意：如果出現(xiàn)結(jié)晶，請將溶液放于室溫下?lián)u動，重新完全溶解。
顯色劑：備用。
終止液：備用。
10 分析步驟
10.1 注意事項
－ 使用前請將試劑盒恢復到室溫（20～25℃）
－ 使用后請立即將所有試劑放回2～8℃
－ 請不要改動分析步驟，尤其：
－ 不要在低于20℃條件下溫浴
－ 要使用準確和精確的移液槍和適合的槍頭
－ 一旦開始實驗，完成所有步驟，不要中斷
－ ELISA結(jié)果的重復性跟洗板的效果和一致性非常密切，請遵循操作方法
－ 不同的樣品和標準品使用一次性槍頭以避免交叉污染
－ 不要讓槍頭和微孔中的溶液或內(nèi)避接觸
10.2 檢測程序
1. 用記錄表記錄B0，標準品和樣品的位置，要求做雙孔平行。
2. 加入標準品和樣品：
－50ul氯霉素樣品稀釋液加入B0孔
－標準品或樣品50ul加入微孔
3. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul酶標物溶液。
4. 晃動酶標板。
5. 室溫（20～25℃）下溫浴10min。溫浴過程中建議晃動酶標板2～3次。
6. 清洗步驟：
－ 倒去微孔中的溶液
－ 用擠瓶將所有微孔加滿清洗液，然后倒去
－ 在吸水紙上拍打除去殘留溶液
重復清洗四遍。
不要讓微孔干燥。
7. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul反應液。
8. 輕輕晃動酶標板。
9. 室溫（20～25℃）下溫浴10min。
10. 用多通道移液槍在所有微孔中加入100ul的終止液。
11. 輕輕晃動酶標板。
12. 在450nm下檢測吸光度，結(jié)果在10min內(nèi)讀取最佳，30min內(nèi)有效。
11 結(jié)果計算
－ 計算最大結(jié)合率（B0）、標準品和樣品的平均吸光度
－ 根據(jù)以下公式來計算標準品和樣品的結(jié)合率
＝B/B0 (%)
標準品（或樣品）吸光度
×100
最大結(jié)合孔吸光度
－ 根據(jù)標準品的B/B0值在半對數(shù)曲線中畫出標準曲線
－ 獲得樣品的B/B0值后在標準曲線上可以得到對應的氯霉素濃度值ppb（ug/kg或ug/L），實際濃度還要乘上稀釋倍數(shù)。
12檢測下限
組織 0.1ng/g
尿液和奶樣 0.2ng/mL
13 特異性
|
分子
|
交叉反應％
|
|
氯霉素
|
100
|
|
琥珀氯霉素
|
92
|
|
氯霉素-葡萄糖苷酸
|
57
|
|
阿莫西林
|
< 0.1
|
14標準曲線模型
北京祥龍環(huán)宇生物技術有限公司
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