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呋喃唑酮代謝物(AOZ)ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2009-03-04
核心提示:一、概要 用來(lái)檢測(cè)呋喃唑酮代謝物的最常用方法是LC-UV,LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù),采用AOZ衍生物的特異性抗體,具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度,較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測(cè)時(shí)間,檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)在檢測(cè)中很好的表現(xiàn)出來(lái)。(本試劑盒的檢測(cè)時(shí)間

一、概要
用來(lái)檢測(cè)呋喃唑酮代謝物的最常用方法是LC-UV,LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫方法結(jié)合了色譜技術(shù),采用AOZ衍生物的特異性抗體,具有很高的準(zhǔn)確度和靈敏度,較低的操作技術(shù)要求和短暫的檢測(cè)時(shí)間,檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)在檢測(cè)中很好的表現(xiàn)出來(lái)。(本試劑盒的檢測(cè)時(shí)間為1.5小時(shí)。)

二、試驗(yàn)原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留的AOZ經(jīng)衍生化后和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃唑酮代謝物的衍生物抗體,加入酶標(biāo)二抗后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物AOZ的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù),即可得出樣品中呋喃唑酮代謝物的殘留量。

三、適用范圍
可定性、定量檢測(cè)動(dòng)物組織(雞、豬、牛等)、牛奶、蜂蜜和雞蛋樣本中的呋喃唑酮代謝物的殘留量。

四、交叉反應(yīng)率
呋喃唑酮代謝物……………………………………   100%
呋喃它酮代謝物…………………………………小于 0.1%
呋喃妥因代謝物…………………………………小于 0.1%
硝基糠腙(呋喃西林)代謝物…………………小于0.1%
呋喃唑酮…………………………………………………16.3%
呋喃它酮………………………………………………小于1%
呋喃妥因………………………………………………小于1%
硝基糠腙(呋喃西林)………………………………小于1%

五、使用單位需自備的設(shè)備及試劑
設(shè)備:
┅┅微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm
┅┅旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置
┅┅均質(zhì)器
┅┅振蕩器
┅┅渦旋儀
┅┅離心機(jī)
┅┅天平:感量0.01g
┅┅刻度移液管:10ml
┅┅洗耳球
┅┅容量瓶: 100ml、1L
┅┅玻璃試管:10ml
┅┅聚苯乙烯離心管:2ml、10ml、50ml
┅┅微量移液器:?jiǎn)蔚?20ml~200ml、100ml~1000ml
多道 250ml
試劑:
┅┅乙酸乙酯(分析純)
┅┅正己烷(或正庚烷)(分析純)
┅┅三水合磷酸氫二鉀(分析純)
┅┅濃鹽酸
┅┅氫氧化鈉(分析純)
┅┅二水合亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5·NO·2H2O)(分析純)(供奶、雞蛋樣用)
┅┅七水合硫酸鋅(ZnSO4·7 H2O) (分析純)(供奶、雞蛋樣用)
┅┅去離子水

六、提供的材料與試劑
1、96孔酶標(biāo)板×1塊(包被有偶聯(lián)抗原)
2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶:(1ml/瓶)
  0ppb,0.05ppb,0.15ppb,0.45ppb,1.35ppb,4.05ppb       3、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品:(1ml/瓶) 100ppb
4、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液      1.5ml …………………… 紅色帽
5、抗體濃縮液        0.8ml……………………綠色帽
6、底物液 A 液       7ml …………………… 白色帽
7、底物液 B 液       7ml …………………… 紅色帽
8、終 止 液          7ml …………………… 黃色帽
9、20×濃縮洗滌液    40ml………………………透明帽
10、2×濃縮復(fù)溶液    50ml……………………藍(lán)色帽
11、2-硝基苯甲醛       15.1mg……………………黑色帽

七、溶液的配制
配液1: 衍生化試劑
向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至10ml(濃度為10mM)。
配液2: 0.1M磷酸氫二鉀溶液
            稱(chēng)取22.8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水溶解定容至1L。
配液3: C液(供奶樣、雞蛋用):
0.36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe(CN)5·NO·2H2O)溶液
             稱(chēng)取10.7g 亞硝基鐵氰化鈉加去離子水溶解定容至100ml
      D液(供奶樣、雞蛋用):
1M硫酸鋅(ZnSO4·7H2O)溶液
             稱(chēng)取28.8g 硫酸鋅用去離子水溶解定容至100ml
配液4: 1M鹽酸溶液      
量取8.3ml濃鹽酸加入到盛有去離子水的容器中定容至100ml。
配液5: 1M 氫氧化鈉溶液
        稱(chēng)取4.0g氫氧化鈉加去離子水溶解定容至100ml。
配液6: 復(fù)溶工作液
用去離子水將2×濃縮復(fù)溶液按1:1體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份2×濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于抗體濃縮液、酶標(biāo)二抗?jié)饪s液的稀釋及提取樣本的復(fù)溶,復(fù)溶工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。
配液7: 洗滌液工作液
用去離子水將20×濃縮洗滌液按1:19體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份20×濃縮洗滌液+19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌,洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個(gè)月。

八、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
處理任何樣本時(shí),都必須注意:
(a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。
(b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否潔凈,必須使用潔凈實(shí)驗(yàn)器具,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
(c)衍生化試劑可于2-8℃保存半年。
(d)磷酸氫二鉀溶液可于2-8℃保存三個(gè)月
(e)鹽酸溶液可于室溫保存三個(gè)月
(f)氫氧化鈉溶液可于室溫保存三個(gè)月
(g)未處理的樣本冷凍保存。
(h)處理好的樣本可在2-8℃避光保存24小時(shí)
(i)雞蛋樣本前處理過(guò)程中,50℃水浴2小時(shí),中間每半小時(shí)必須用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘,它直接影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。
(一)肌肉、肝臟組織前處理方法
┅┅用均質(zhì)器均質(zhì)樣本;
┅┅接(四)的描述方法。
注:樣本應(yīng)當(dāng)在陰涼避光處冷藏保存
(二)牛奶前處理方法
┅┅取牛奶樣本,3000g以上,10℃離心10min,吸除上層脂肪;
┅┅取5ml去除脂肪牛奶樣本至10ml聚苯乙烯離心管中;
┅┅分別加入250ml C液和250ml D液(見(jiàn)配液3);
┅┅用振蕩器充分振蕩混合,3000g以上,4~12 oC(39-54℉)離心10min。如果沒(méi)有恒溫離心機(jī),則先將樣本降溫至大約8 oC(46℉),然后離心;
┅┅接(四)的描述方法
(三)蜂蜜前處理方法
┅┅稱(chēng)取1.0±0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中;
┅┅用4ml去離子水,用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解;
┅┅加入0.5ml 1M鹽酸溶液(見(jiàn)配液4)和100ml衍生化試劑(見(jiàn)配液1),用振蕩器充分振蕩;
┅┅接(四)第二步描述方法(標(biāo) * 處)。
(四)接上面的方法
┅┅稱(chēng)取1.0±0.05g均質(zhì)后的組織樣本(肝樣/肉樣)、制備好的牛奶樣本上清液1.1ml(相當(dāng)于1ml的奶樣),分別加入4ml的去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液(見(jiàn)配液4)和100ml衍生化試劑(見(jiàn)配液1),用振蕩器充分振蕩2min;
*┅┅在37 oC過(guò)夜孵育(大約16h);
┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液(見(jiàn)配液2)、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液(見(jiàn)配液5)和5ml乙酸乙酯,用振蕩器劇烈振蕩30s;
┅┅3000g以上,室溫(20-25 oC/68-77℉)離心10min;
┅┅取2.5ml乙酸乙酯相至10ml干燥的玻璃試管中,于50~60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?/div>
┅┅加入1ml正己烷(或正庚烷),用渦旋儀渦動(dòng)30s,再加入1ml復(fù)溶工作液(見(jiàn)配液6),用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻;
┅┅3000g以上,室溫(20-25 oC/68-77℉)離心10min;
┅┅除去上層有機(jī)相,取下層水相50µl用于分析。
(五)雞蛋前處理方法
┅┅用均質(zhì)器低速均質(zhì)樣本(蛋黃或全蛋);
┅┅稱(chēng)取2.0±0.05g均質(zhì)過(guò)的蛋樣本至10ml聚苯乙烯離心管中,分別加入4ml去離子水、0.5ml 1M 鹽酸溶液(見(jiàn)配液4)、200µl C液(見(jiàn)配液3),用振蕩器振蕩1min混勻;
┅┅加入200µl D液(見(jiàn)配液3),用振蕩器充分振蕩5min,3000g以上,室溫(20-25 oC/68-77℉)離心10min;
┅┅取全部上清液至15ml聚苯乙烯離心管中,加入200µl衍生化試劑(見(jiàn)配液1),用振蕩器充分振蕩,50℃水浴2h(中間每半小時(shí)用振蕩器劇烈振蕩1-2分鐘);
┅┅分別加入5ml 0.1M 磷酸氫二鉀溶液(見(jiàn)配液2)、0.4ml 1M 氫氧化鈉溶液(見(jiàn)配液5)5ml乙酸乙酯,用振蕩器劇烈振蕩30s,3000g以上,室溫(20-25 oC/68-77℉)離心10min;
┅┅取2.5ml上層有機(jī)相,于50~60℃氮?dú)饬飨麓蹈桑?/div>
┅┅加入1ml正己烷(或正庚烷),用渦旋儀渦動(dòng)30s,再加入2ml復(fù)溶工作液(見(jiàn)配液6),用渦旋儀渦動(dòng)1min充分混勻;(如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象,請(qǐng)于60℃水浴中加熱5min,再重復(fù)離心);
┅┅除去上層有機(jī)相,取下層水相50µl用于分析。

九、檢測(cè)步驟
測(cè)定前應(yīng)須知:
1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫(20-25℃)。
2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。
4、在所有恒溫孵育過(guò)程中,避免光線照射,用蓋板膜封住微孔板。
 操作步驟:
1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出,置于室溫(20-25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、取出需要數(shù)量的微孔板,將不用的微孔板放入自封袋,保存于2-8℃。
3、洗滌工作液在使用前也需回溫。
4、編號(hào):將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào),每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、抗體工作液的稀釋?zhuān)簩⒖贵w濃縮液用復(fù)溶工作液按照1:10體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份抗體濃縮液加入10份復(fù)溶工作液)。
6、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本:加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50ml到對(duì)應(yīng)的微孔中,然后加入抗體工作液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。
7、洗板:小心揭開(kāi)蓋板膜,將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌工作液(見(jiàn)配液7)250ml/孔,充分洗滌4-5次,每次間隔10s,用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破)。
8、酶標(biāo)二抗工作液的稀釋?zhuān)簩⒚笜?biāo)二抗?jié)饪s液用復(fù)溶工作液按照1:10體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)?份酶標(biāo)二抗?jié)饪s液加入10份復(fù)溶工作液)。
9、加酶標(biāo)二抗:加入酶標(biāo)二抗100ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min,取出重復(fù)洗板步驟7。
10、顯色:加入底物液A液50ml/孔,再加底物液B液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min(見(jiàn)注意事項(xiàng)8)。
11、測(cè)定:加入終止液50ml/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè),請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)),測(cè)定每孔OD值。(若無(wú)酶標(biāo)儀,則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與呋喃唑酮代謝物的含量成負(fù)相關(guān)。
1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310,樣本2的吸光度值為0.820,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.104;0.05ppb為1.224;0.15ppb為0.859;0.45ppb為0.522; 1.35ppb為0.270;4.05ppb為0.129。則樣本1的濃度范圍是0.45ppb-1.35ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍;樣本2的濃度范圍是0.15ppb-0.45ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物殘留的濃度范圍。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光度值(%)=
B
×100%
B0
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度,乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃唑酮代謝物的實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專(zhuān)業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來(lái)電索。
樣本稀釋倍數(shù)
肌肉、肝臟組織樣品稀釋倍數(shù):2
奶樣樣品稀釋倍數(shù):2
蜂蜜樣品的稀釋倍數(shù):2
雞蛋樣品的稀釋倍數(shù):2  

十一、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度
試劑盒靈敏度:0.05ppb
樣本最低檢測(cè)限:
組織、蜂蜜 ……………………………………………0.1ppb
雞蛋、奶樣………………………………………………0.1ppb
準(zhǔn)確度:
肌肉、肝臟組織 ……………………………… 75±15%
蜂蜜 …………………………………………… 90±15%
雞蛋 …………………………………………… 90±20%
奶樣………………………………………………… 90±10%
精密度:
試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)
1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫(20-25℃)會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、每加一種試劑前需要將其搖勻。
4、反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒;也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑,摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。
6、儲(chǔ)存條件
保存試劑盒于2-8℃,不要冷凍,將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、試劑變質(zhì)的跡象
發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值小于0.5(A450nm<0.5 )時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8、在加入底物液A液和底物液B液后,一般顯色10-15min即可。若顏色較淺,可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min(或更長(zhǎng)),但不得超過(guò)30min。反之,則減短反應(yīng)時(shí)間。
9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃,溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期
     貯藏條件:保存試劑盒于2~8℃。
保存期:該產(chǎn)品有效期為12個(gè)月.

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