一、目的要求 |
1.掌握反相離子對色譜分離水溶性纖維素的方法。
2.了解反相離子對色譜分離水溶性纖維素的原理及方法特點。
|
二、基本原理 |
水溶性纖維素包括:VB1 (硫胺素),VB2(核黃素),VB5(煙酰胺,煙酸),VB6(吡哆醛、吡哆醇),VB11(葉酸),VB12(鈷
維生素)和VC等。在用反相離子對色譜法測定中,陽離子A+(樣品離子)和反離子B-(烷基磺酸根離子)先形成離于對,再在
流動相和固定相中分配,
保留時間為:
tR=tM (1+ EA,B[B-]水相/β)
式中,β為相比,tM為死時間,EA,B為平衡常數(shù)。
可見樣品的保留時間受離子對試劑的濃度和可逆過程的總平衡常數(shù)的影響。因此,對混合水溶性纖維素分離的影響,
除反離子的濃度外,還有流動相的pH值,甲醇與水的配比,有機添加劑三乙胺(TEA)濃度和柱溫。TEA作為流動相的添加
劑,可減少堿性樣品色譜峰的拖尾。
|
三、儀器與試劑 |
1.儀器高效液相色譜儀;超聲波發(fā)生器。
2.試劑:
甲醇;十二烷基磺酸鈉;三乙胺;水溶性纖維素混合標樣。
混合標樣配制方法:
將VB1、煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、VB12和VC溶于水配成含量均為30μg/m1的水溶液(溶液1)。將VB2和VB11滴入少
量發(fā)5%Na0H使之溶解,再用去離子水稀釋至各含100μg/m1的混合液(溶液2)。使用前,將溶液l和溶液2以1:1混合
,配成含9種纖維素的混合標樣。以相應(yīng)的方法制成各維生素的單個標樣。
|
四、實驗步驟 |
1.實驗條件:
1) 色譜柱:YWG—G18,10μm,25cm×φ4.6mm;
2) 流動相:甲醇:水=40:60,十二烷基磺酸鈉1.5mmol/l,三乙胺0.3%,用磷酸調(diào)節(jié)PH至3.0;
3) 檢測器:UV—254nm;
4) 流動相流速:1.0mI/mln;
5) 校溫:30℃。
2.啟動儀器,用大約180m1流動相流經(jīng)色譜拄,待基線穩(wěn)定后,分別注入10μl的各單個維生素標樣,記錄色譜圖
和出峰時間。
3.注入10μll混合試樣,記錄色譜圖和各峰的出峰時間。
4.實驗結(jié)束,用90%甲醇一水溶液沖洗色譜拄1h左右。
|
五、數(shù)據(jù)處理 |
根據(jù)標樣的保留時間找出混合試樣色譜圖中各峰對應(yīng)的樣品名稱。 |
六、問題討論 |
1.試述反相離子對色譜的分離機理。
2.反相離子對色譜同時分離混合水溶性纖維素有哪些影響因素?
|
七、渣意事項 |
1.制備流動相用試劑均為分析純,水用二次蒸餾水,維生素為生物試劑。
2.用庚烷鹽作為離子對試劑效果更優(yōu),但其價格較貴。
|