┅┅加1ml 0.02 M磷酸鹽緩沖液（見(jiàn)配液1）溶解；

┅┅取20ml用于分析

（五）尿液前處理方法

┅┅將尿液于3000g以上，室溫（20-25℃）離心5min，直至尿液樣本清亮；

┅┅移取1ml清亮尿液至10ml干凈的玻璃試管中，加入3ml提取工作液混合；

┅┅取20ml用于分析。

 （六）牛奶前處理方法

┅┅取牛奶樣本，3000g以上，10℃離心10min，吸除上層脂肪；

┅┅移取1ml離心后的牛奶樣本至10ml干凈的玻璃試管中，加入0.02 M 磷酸鹽緩沖液（見(jiàn)配液1）按1︰19的體積比進(jìn)行稀釋?zhuān)��?0ml牛奶+380ml 0.02磷酸鹽緩沖液）；

┅┅取20ml用于分析。

九、檢測(cè)步驟

測(cè)定前應(yīng)須知：

1、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20-25℃）。

2、使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測(cè)定程序中的要點(diǎn)。

4、在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線(xiàn)照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟：

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、洗滌工作液在使用前也需回溫。

4、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本20ml到對(duì)應(yīng)的微孔中，然后加抗體工作液80ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、洗板：小心揭開(kāi)蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液（見(jiàn)配液5）250ml/孔，充分洗滌4－5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用未使用過(guò)的槍頭戳破）。

7、加酶標(biāo)二抗：加酶標(biāo)二抗100ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)20min，取出重復(fù)步驟6。

8、顯色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min（見(jiàn)注意事項(xiàng)8）。

9、測(cè)定：加入終止液50ml/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)定每孔OD值。(若無(wú)酶標(biāo)儀，則不加終止液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。

十、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含磺胺類(lèi)藥物的含量成負(fù)相關(guān)。

1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.211，樣本2的吸光度值為0.785，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.100；2ppb為1.680；4ppb為1.210；8ppb為0.580；16ppb為0.308；32ppb為0.120。則樣本1的濃度范圍是16ppb-32ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類(lèi)藥物殘留的濃度范圍；樣本2的濃度范圍是4ppb-8ppb再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中磺胺類(lèi)藥物殘留的濃度范圍。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以磺胺類(lèi)藥物標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ppb）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中磺胺類(lèi)藥物的實(shí)際濃度

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樣本稀釋倍數(shù)

組織樣品稀釋倍數(shù)

高檢測(cè)限樣本：

（a）方法處理肌肉/肝臟和雞蛋樣品稀釋倍數(shù)：2

（b）方法處理魚(yú)、蝦樣品稀釋倍數(shù)：2

低檢測(cè)限樣本

肌肉/肝臟： 5

血清樣品稀釋倍數(shù)：4

蜂蜜樣品稀釋倍數(shù)：1

尿樣樣品稀釋倍數(shù)：4

奶樣樣品稀釋倍數(shù)：20

十一、檢測(cè)方法靈敏度、準(zhǔn)確度、精密度

試劑盒靈敏度：2ppb

樣本最低檢測(cè)限：

血清樣本/尿樣檢測(cè)下限…………………………………8ppb

牛奶樣本檢測(cè)下限………………………………………40ppb

組織樣本檢測(cè)下限

高檢測(cè)限

肌肉/肝臟和雞蛋……………………………………… 4ppb

魚(yú)、蝦…………………………………………………… 4ppb

低檢測(cè)限

肌肉/肝臟………………………………………………10ppb

準(zhǔn)確度：

雞肉/肝、豬肉/肝……………………………………75±10%

雞蛋…………………………………………………69±10%

蜂蜜、牛奶、血清……………………………………70±10%

精密度：

試劑盒的變異系數(shù)均小于10%

十二、注意事項(xiàng)

1、室溫低于20℃或試劑及樣本沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)不成線(xiàn)性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、每加一種試劑前需要將其搖勻。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過(guò)了有效日期的試劑盒；也不要使用過(guò)了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過(guò)了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中的試劑。

6、儲(chǔ)存條件

保存試劑盒于2-8℃，不要冷凍，將不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線(xiàn)下。

7、試劑變質(zhì)的跡象

發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度（450/630nm）值小于0.5（A450nm<0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、在加入底物液A和底物液B液后，一般顯色20min即可。若顏色較淺，可延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到25min（或更長(zhǎng)），但不得超過(guò)30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。

9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過(guò)高或過(guò)低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

十三、貯藏條件及保存期

     貯藏條件：保存試劑盒于2~8℃。