(三)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜前后進(jìn)行的RNA染色
當(dāng)RNA自瓊糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜之前,溴化乙錠的染色時間一般不宜過長,這是因為被染料飽和的核酸分子,其轉(zhuǎn)移效率有所降低。然而,用溴化乙錠作短暫染色,既不至于對核酸轉(zhuǎn)移過程產(chǎn)生可以察覺的掏作用,又獨具同時檢測凝膠和凝膜上的RNA的優(yōu)點。
1.方法I
1)電泳結(jié)束后,含乙二醛-DMSO的凝膠應(yīng)浸入含溴化乙錠(0.5 μg/ml)的10mmol/L磷酸鈉(pH7.0)溶液。甲醛凝膠需用無RNA酶的水淋洗,用20xSSC溶液浸泡,隨后用含溴化乙錠(0.5μg/ml)的20x
SSC溶液染色。
2)于室溫染色5-10分鐘,在紫外燈下觀察,照像。
3)按前所述方法, 將凝膠中的RNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,轉(zhuǎn)移后能常在學(xué)光下也可看出已染色的RNA條帶。
這種方法僅適用于每一泳道均含有相當(dāng)大量(如5μg 以上)的RNA的情況。
2.方法Ⅱ
硝酸纖維素濾膜上的RNA也可以用下述方法染色:從干烤后的硝酸纖維素濾膜上剪下所需的條帶進(jìn)行染色,也可以用經(jīng)過雜交并經(jīng)X光片曝光后的整張濾膜進(jìn)行染色(A.Efstratiadis,未了表材料)。
1)將干燥的濾膜浸入5%冰乙酸中,于室溫浸泡15分鐘。
2)再將濾膜轉(zhuǎn)移至0.5mol/L乙酸鈉(pH5.2)、0.04%亞甲藍(lán)溶液中, 于室溫浸泡5-10分鐘。
3)用水淋洗濾膜5-10分鐘后,可見RNA分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物帶型銳利而poly(A)+mRNA為一模糊帶型,由許多長度范圍從500堿基以下至5kb以上的各種mRNA共同組成,mRNA的平均長度約為2kb。