電泳完畢后,可立即將乙醛酰RNA自瓊脂糖凝膠轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,有以下幾種轉(zhuǎn)移方法:毛細(xì)管洗脫法、真空轉(zhuǎn)移法和電印跡法。毛細(xì)管洗脫法如下所述, 真空轉(zhuǎn)移法和印跡法則按有關(guān)儀器生產(chǎn)廠家產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。盡管有人認(rèn)為在轉(zhuǎn)移前對(duì)瓊脂糖凝膠進(jìn)行預(yù)處理實(shí)屬不必(Thomas,1980)甚至有害(Thomas,1983),
但我們認(rèn)為含甲醛的凝膠必須用經(jīng)DEPC處理的水淋洗數(shù)次,除去甲醛。 如果瓊脂糖中濃度大于1%或凝膠厚度大于0.5cm或待分析的RNA大于2.5kb,需用0.05mol/L氫氧化納浸泡凝膠20分鐘。 然后在凝膠上放置硝酸纖維素凝膜或尼龍膜,RNA隨向上遷移的緩沖液轉(zhuǎn)移至固相支持體(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
1)將凝膠移至一個(gè)玻璃皿內(nèi),用鋒利刀片修凝膠的無(wú)用部分,在凝膠左上角(加樣孔一端為上)切去一角,以作為下列操作過(guò)程中凝膠方位的標(biāo)記。
2)用長(zhǎng)和寬均大于凝膠的一塊Plexiglas有機(jī)玻璃或一疊玻璃板作為平臺(tái),將其放入大千烤皿內(nèi),上面放一張Whatman 3MM濾紙,倒入20xSSC使液面略低于平臺(tái)表面,當(dāng)平上方的3MM濾紙溫透后,用玻棒趕出所有的氣泡。
3)用一把新的解剖刀或切紙刀裁一張硝酸纖維素濾膜(Schleicher &Schuell BA85或與之相當(dāng)?shù)漠a(chǎn)品)。濾膜的長(zhǎng)度和寬度應(yīng)分別比凝膠大1mm, 接觸濾膜時(shí)須戴手套或用平頭鑷子(例如Millipore鑷子),用有油膩的手接觸過(guò)的硝酸纖維素濾膜不易浸溫。
4)將硝酸纖維素濾膜浮在去離子水表面,直至濾膜從下向上濕透為止,隨后用20xSSC浸泡濾膜至少5分鐘,用干凈的解剖刀片切去濾膜一角, 使其與凝膠的切角相對(duì)應(yīng)。不同批號(hào)的硝酸纖維膜,其浸濕速率相差懸殊。如濾膜池浮在水面上幾分鐘后仍未濕透,應(yīng)另?yè)Q一張新濾膜,因?yàn)槲淳鶆蚪䴘竦臑V膜進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)移是靠不住的。這種濾膜也不必丟棄,可將其夾在用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間, 高壓5分鐘。通常上述處理足以使硝酸纖維素濾膜濕透。高壓處理的濾膜應(yīng)夾在經(jīng)過(guò)高壓理理并用2xSSC浸濕的3MM濾紙中間,裝入塑料袋, 密封后于4℃保存?zhèn)溆谩?BR>5)將凝膠翻轉(zhuǎn)后置于平臺(tái)上溫潤(rùn)的3MM濾紙中央,3MM濾紙和凝膠這間不能滯留氣泡。
6)用Saran包裝膜或Parafilm膜圍繞凝膠周邊,但不是覆蓋凝膠, 以此作為屏障,阻止液體自液池直接流至凝膠上方的紙巾層中。并非堆放得十分整齊的紙巾,易于從凝膠的邊緣垂下并與平臺(tái)接觸,這種液流的短路是導(dǎo)致凝膠中的RNA的轉(zhuǎn)移效率下降的主要原因。
7)在凝膠上方放置溫潤(rùn)的硝酸纖維素濾膜,并使兩者的切角相重疊。濾膜的一條邊緣應(yīng)剛好超過(guò)凝膠上部加樣孔一線的邊緣。濾膜置于凝膠表面適當(dāng)位置后,就不應(yīng)輕易移動(dòng),濾膜與凝交之間不應(yīng)留有氣泡。
8)用2xSSC溶液浸濕兩張與凝膠同樣大小的3MM濾紙, 溫潤(rùn)的放置在濕潤(rùn)的硝酸纖維濾膜上方。用玻璃棒趕出其間滯留的氣泡。
9)切一疊(5-8cm高)略小于3MM濾紙的紙巾,將其放置在3MM濾紙的上方。并在紙巾上方放一塊越境玻璃板,然后用-500g的重物壓實(shí)。其目的是建立液體自液池經(jīng)凝膠向硝酸纖維素濾膜的上行流路,以洗脫凝膠中的RNA并使其聚集在硝酸纖維素濾膜上。
10)使上述RNA轉(zhuǎn)移持續(xù)進(jìn)行6-18小時(shí),每當(dāng)紙巾浸濕后,應(yīng)換凝的紙巾。
11)轉(zhuǎn)移結(jié)束后,揭去凝膠上方的紙巾和3MM濾紙,翻轉(zhuǎn)凝膠和硝酸纖維素濾膜,以凝膠的一面在上,置于一張干的3MM濾約紙上,用一支極軟鉛筆或圓珠筆,在濾膜上標(biāo)記凝膠加樣孔的位置。
12)從硝酸纖維素濾膜上剝離凝膠棄之。以6x SSC溶液于室溫浸泡濾膜5分鐘,這一步可以除去粘著在濾膜上的瓊脂糖碎片。從6xSSC溶液中取出濾膜,將濾膜上的溶液滴盡后平放在一張紙巾上。于室溫晾干30分鐘以上。為估計(jì)RNA的轉(zhuǎn)移效率, 可將膠置于溴化乙錠溶液(0. 5 μg/ml , 以0.1mol/L乙酸銨配制)中染色45分鐘,于紫外燈下觀察。
13)將晾干的濾膜放在兩經(jīng)張3MM濾紙中間,用真空爐于80℃干烤0.5-2 小時(shí)。如干烤時(shí)間過(guò)長(zhǎng),濾膜極易脆裂并可能發(fā)黃。如果濾膜并不立即用于雜交實(shí)驗(yàn),可用鋁箔寬松地包裹起來(lái),在真空下貯存于室溫。
14)僅適用于濾膜上含有乙醛酰PNA的情況:雜交前需用20mmol/L Tris.Cl(pH8.0)于65℃洗膜,除去RNA上的乙二醛分子。