（一）外源ＤＮＡ和質(zhì)粒載體的連接反應(yīng)

　　外源ＤＮＡ片段和線狀質(zhì)粒載體的連接，也就是在雙鏈ＤＮＡ５'磷酸和相鄰的3'羥基之間 形成的新的共價(jià)鏈。如質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成４個(gè)新的磷酸二酯鏈。但如果質(zhì)粒ＤＮＡ已去磷酸化，則吸能形成２個(gè)新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產(chǎn)生的兩個(gè)雜交體分子帶有２個(gè)單鏈切口，當(dāng)雜本導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。相鄰的５'磷酸和３'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的ＤＮＡ連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌ＤＮＡ連接酶和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶。實(shí)際上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶都是首選的用酶。這是因?yàn)樵谙鲁练磻?yīng)條件下，它就能有效地將平端ＤＮＡ片段連接起來。
　　ＤＮＡ一端與另一端的連接可認(rèn)為是雙分子反應(yīng)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下，其反應(yīng)速度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的濃度決定。不論末端位于同一ＤＮＡ分子（分子內(nèi)連接）還是位于不同分子（分子間連接），都是如此�，F(xiàn)考慮一種簡(jiǎn)單的情況，即連接混合物中只含有一種ＤＮＡ，也就是用可產(chǎn)生粘端的單個(gè)限制酶切割制備的磷酸化載體ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反應(yīng)中ＤＮＡ濃度低，則配對(duì)的兩個(gè)末端同一ＤＮＡ分子的機(jī)會(huì)較大（因?yàn)椋模危练肿拥囊粋�(gè)末端找到同一分子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。這倦，在ＤＮＡ濃度低時(shí)，質(zhì)粒ＤＮＡ重新環(huán)化將卓有成效。如果連接反應(yīng)中ＤＮＡ濃度有所增高，則在分子內(nèi)連接反應(yīng)發(fā)生以前，某一個(gè)ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ濃度高時(shí)，連接反的初產(chǎn)物將是質(zhì)粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時(shí)參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第２、３期合刊）從理論上探討了ＤＮＡ濃度對(duì)連接產(chǎn)物性質(zhì)的影響。簡(jiǎn)而言之，環(huán)化的連接產(chǎn)物與多聯(lián)體連接產(chǎn)物的比取決于兩個(gè)參數(shù)：j和i。j是ＤＮＡ分子的一個(gè)末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數(shù)值是根據(jù)如下一種假設(shè)作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈隨機(jī)卷曲。這樣，j與ＤＮＡ分子的長(zhǎng)度成反比（因?yàn)椋模危猎介L(zhǎng)，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對(duì)給定長(zhǎng)度的ＤＮＡ分子來說是一個(gè)常數(shù)，與ＤＮＡ深度無關(guān)。j＝[3/(3πl(wèi)b0)]3/2其中l(wèi)是ＤＮＡ長(zhǎng)度，以cm計(jì)，b是隨機(jī)卷曲的ＤＮＡ區(qū)段的長(zhǎng)度。b的值以緩沖液的離子強(qiáng)度為轉(zhuǎn)移，而后者可影響ＤＮＡ的剛度。
i是溶液中所有互補(bǔ)末端的深度的測(cè)量值，對(duì)于具有自身互補(bǔ)粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這里Ｎo是阿佛伽德羅常數(shù)，Ｍ是ＤＮＡ的摩爾濃度（單位：mol/L)。理論上，當(dāng)j=i時(shí)，給定ＤＮＡ分子的一個(gè)末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應(yīng)的初始階段中，環(huán)狀分子與多聯(lián)體分子的生成速率相等。而當(dāng)j>i時(shí)，有利于重新環(huán)化；當(dāng)i>j，則有利于產(chǎn)生多聯(lián)體。圖1.9顯示了ＤＮＡ區(qū)段的大小與連接反應(yīng)混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時(shí)所需ＤＮＡ濃度之間關(guān)系（Ｄugaiczyk等，1985）。 現(xiàn)在考慮如下的連接反應(yīng)混合物：其中除線狀質(zhì)粒之外，還含有帶匹配末端的外源ＤＮＡ片段。對(duì)于一個(gè)給定的連接混合物而言，產(chǎn)生單體環(huán)狀重組基因組的效率不僅受反應(yīng)中末端的絕對(duì)濃度影響， 而且還受質(zhì)粒和外源ＤＮＡ末端的相對(duì)濃度的影響。當(dāng)i是j的２－３倍（即末端的絕對(duì)濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時(shí)）外源ＤＮＡ末端濃度的２倍時(shí)，有效重組體的產(chǎn)量可達(dá)到最大。這些條什下，連接反應(yīng)終產(chǎn)物的大約40％都是由單體質(zhì)粒與外源ＤＮＡ所形成的嵌合體。當(dāng)連接混合物中線瘃質(zhì)粒的量恒定（j:i=3）而帶匹配末端的外源ＤＮＡ的量遞增時(shí)，這種嵌合體在連接反應(yīng)之末的理論產(chǎn)量。
涉及帶粘端的線狀磷酸化質(zhì)粒ＤＮＡ的連接反應(yīng)應(yīng)包含：
１）足量的載體ＤＮＡ，以滿足j:i>1和j:i<3。對(duì)一個(gè)職pUC18一般大小的質(zhì)粒，這意味著連接反應(yīng)中應(yīng)含有載體ＤＮＡ為20-60μg/ml。
２）未端濃度等于或稍高于載體ＤＮＡ的外源ＤＮＡ，如外源ＤＮＡ濃度比載體低得多，在效連接產(chǎn)物的數(shù)量會(huì)很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉(zhuǎn)化菌落。這種情況下，可考慮采用一些步驟來減少帶非重組質(zhì)粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質(zhì)粒ＤＮＡ或發(fā)跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構(gòu)建重組質(zhì)粒。

(二）粘端連接

１）用適當(dāng)?shù)南拗泼赶�化質(zhì)粒和外源ＤＮＡ。如有必要，可用凝膠電泳分離片段并（或）用堿性磷酸酶處理質(zhì)粒ＤＮＡ。通過酚：氯仿抽提和乙沉淀來純化ＤＮＡ，然后用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。
２）按如下所述設(shè)立連接反應(yīng)混合物：
a．將0.1μl載體ＤＮＡ轉(zhuǎn)移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源ＤＮＡ。
b．加水至7.5μl，于45℃加溫５分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到０℃。
c．加入：10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液 １μl
Ｔ４噬菌體ＮＤＡ連接酶 0.1Weiss單位
５mmol/L ATP 1μl
于16℃溫育１－４小時(shí)

10xT4噬菌體ＤＮＡ連接酶緩沖液
200mmol/L同Tris.Cl(pH7.6)
50mmol/K MgCl2
50mmol/L二硫蘇糖醇
500μg/ml牛血清白蛋白（組分Ｖ.Sigma產(chǎn)品）（可用可不用）
該緩訓(xùn)液應(yīng)分裝成小份，貯存于－20℃。
另外，再設(shè)立兩個(gè)對(duì)照反應(yīng)，其中含有（１）只有質(zhì)粒載體；（２）只有外源ＤＮＡ片段。如果外源ＤＮＡ量不足，每個(gè)連接反應(yīng)可用50-100ng質(zhì)粒ＤＮＡ，并盡可能多加外源ＤＮＡ，同時(shí)保持連接反應(yīng)體積不超過10μl。可用至少３種不同方法來測(cè)定Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶的活性。大多數(shù)制造廠商（除New England Biolabs公司外）現(xiàn)在都用Weiss等，１1968)對(duì)該酶進(jìn)行標(biāo)化。１個(gè)Weiss單位是指在37℃下20分釧內(nèi)催化１mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時(shí)，１個(gè)Weiss單位相當(dāng)于0.2個(gè)用外切核酸酶耐受試驗(yàn)來定義的單位（Modrich和Lehman,1970)或者60個(gè)粘端單位（如Ｎew England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Ｗeiss單位的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶在16℃下30分鐘內(nèi)可使50％的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L Tris.Cl(pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50％甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處于這種濃度并在這種緩沖液中的Ｔ４噬體ＤＮＡ連接酶于-20℃保存３個(gè)月可保持穩(wěn)定。
３）每個(gè)樣品各�。保�２μl轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

（三）平端ＤＮＡ連接

　�。裕词删�體ＤＮＡ連接酶不同于大腸桿菌ＤＮＡ連接酶，它可以催化平端ＤＮＡ片段的連接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由于ＤＮＡ很容易成為平端，所以這是一個(gè)極為有用的酶學(xué)物性。有了這樣的物性，才能使任何ＤＮＡ分子彼此相連。然而，相對(duì)而言，平端連接是低效反應(yīng)，它要求以下４個(gè)條件：
１）低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。
２）不存在亞精胺一類的多胺。
３）極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。
４）高濃度的平端。
１．凝聚劑
　　在反應(yīng)混合物中加入一些可促進(jìn)大分子群聚作用并可導(dǎo)致ＤＮＡ分子凝聚成集體的物質(zhì)，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Ｈarrison,1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當(dāng)濃度的平端ＤＮＡ的總是迎刃而解。在連接反應(yīng)中，這些物質(zhì)具有兩作用：
１）它們可使平端ＤＮＡ的連接速率加大１－３個(gè)數(shù)量級(jí)，因此可使連接反應(yīng)在酶ＤＮＡ濃度不高的條件下進(jìn)行。
２）它們可以改變連接產(chǎn)物的分布，分子內(nèi)連接受到抑制，所形成的連接產(chǎn)物一律是分子間連接的產(chǎn)物。這樣，即使在有利于自身環(huán)化（j:i=10）的ＤＮＡ濃度下，所有的ＤＮＡ產(chǎn)物也將是線狀多聚體。\par 在設(shè)立含凝聚劑的連接反應(yīng)時(shí)，下列資料可供參考。
（１）聚乙二醇（PEG8000）
１）用去離子水配制的ＰＥＧ8000貯存液（40％）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應(yīng)混合物之前應(yīng)將其融化并使其達(dá)到室溫。在含15％PEG 8000的連接反應(yīng)混合物中，對(duì)連接反刺激效應(yīng)最為顯著。除PEG 800和Ｔ４噬菌體ＤＮＡ連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應(yīng)于０℃混合，然后加適當(dāng)體積的PEG 8000（處于室溫），混勻，加酶后于20℃進(jìn)行溫育。
２）連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時(shí)對(duì)連接反應(yīng)的刺激效應(yīng)最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或ＭgCl2濃度略有降低，都會(huì)嚴(yán)重降低刺激的強(qiáng)度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。
３）濃度為15％的PEG 8000可刺激帶粘端的ＤＮＡ分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應(yīng)的主產(chǎn)物是串聯(lián)的多聯(lián)體。
４）PEG 8000可刺激短至８?jìng)�(gè)核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。
（２）氯化六氨合高鈷
１）氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存于-20℃，它對(duì)連接反應(yīng)的刺激具有高度的濃度信賴性。當(dāng)連接反應(yīng)混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時(shí)，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的５倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。
２）在單價(jià)陽離子（30mmol/L KCl）存在下，它對(duì)平端連接仍有一定的刺激作用，但此時(shí)連接產(chǎn)物的分布有所改變。連接產(chǎn)物不再是清一色的分子間連接產(chǎn)物，相反，環(huán)狀ＤＮＡ將點(diǎn)盡優(yōu)勢(shì)。
３）與ＰＥＧ 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。