這一從培養(yǎng)的單層哺乳動(dòng)物細(xì)胞中分離RNA的實(shí)驗(yàn)程序系為Favaloro 等(1980)所介紹程序的改良。該程序同樣適用于從懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中或從易于分散成單個(gè)細(xì)胞的哺乳動(dòng)物組織中分離RNA。但不適用于從固體組織中提取RNA,因?yàn)橛眠@種裂解細(xì)胞的方法(在SDS存在的條件下用蛋白酶K消化)去消化組織速度很慢,導(dǎo)致內(nèi)源性RNA酶在被蛋白酶K消化或被抑制劑滅活前有時(shí)間發(fā)揮作用。原方案中(Favaloro等。1980)采用的裂解緩沖液含有0.015 %(W/V)的Macaloid(硅藻土),用于吸附并滅活RNA酶。盡管現(xiàn)仍有Macaloid出售NL Chemicals), 但氧釩核糖核苷復(fù)合物和RNA酶的蛋白質(zhì)抑制劑更常用。下述程序的優(yōu)點(diǎn)是速度快,并能同時(shí)處理很多樣品。
一細(xì)胞的裂解
單層細(xì)胞的裂解
懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解
a.單層細(xì)胞的裂解
a)吸出培養(yǎng)液,以7ml用冰預(yù)冷的無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖鹽溶液PBS沖洗細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的單層細(xì)胞,重復(fù)1次,將平板置于冰上直至所有單層細(xì)胞沖洗完畢。也可將平板放在一塊鋁板上,再將鋁板置于冰盤上。
b)直徑為90mm的培養(yǎng)皿需加0.5ml RNA提取緩沖液, 并使之遍布整個(gè)平板的表面。
RNA提取緩沖注液
0.14mol/L NaCl
1.5mmol/L MgCl2
10mmol/L Tris.Cl(pH8.6)
0.5%NP-40
1mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)
100單位/ml胎盤RNA酶抑制劑或20mmol/L氧釩核糖核苷復(fù)合物
c)加0.5ml蛋白酶消化緩沖液,用刮棒混勻粘稠狀裂解物并將其刮到平板的邊緣。
蛋白酶消化緩沖液
0.2mol/L Tris.Cl(pH8.0)
25mmol/L EDTA(pH8.0)
0.3mol/L NaCl
2% SDS
d)用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3-4次,剪切DNA。
c)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。
蛋白酶K以貯存液的形式保存,貯存液為20mg/ml 蛋白K溶液。
b.懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或組織單細(xì)胞懸液的裂解
a)于4℃以2000g離心5分鐘收集細(xì)胞,以10倍體積用冰預(yù)冷的無(wú)鈣鎂離子磷酸緩沖液懸沉淀,洗滌細(xì)胞3次,每次均用大口徑的吸管輕輕吹打細(xì)胞沉淀,使其徹底分散。
b)估計(jì)細(xì)胞沉淀的體積,用10-20倍體積的RNA提取緩沖液重懸之。
c)加入與步驟b)所加RNA提取緩沖液體相同的蛋白酶消化緩沖液,用振蕩器迅速混勻。用裝有21號(hào)針頭的皮下注射器抽吸細(xì)胞裂解物,再將其注入聚丙烯管內(nèi)。重復(fù)3-4次,剪切DNA。
d)加蛋白酶K至終濃度為200μg/ml,充分混勻后置于37℃溫育30分鐘。蛋白酶K以貯存的形式保存,貯存液為20μg/ml蛋白酶K水溶液。
二提取步驟
1)用等體積酚:氯仿抽提1次,以去除蛋白質(zhì)。
2)用吊桶式轉(zhuǎn)頭于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相, 將水相吸至一個(gè)新的離心管內(nèi),加2.5倍體積用冰預(yù)次序的乙醇,充分混勻, 于0℃放置1小時(shí)。
3)于0℃以5000g離心10分鐘沉淀RNA,棄上清,用含0.1mol/L 乙酸鈉(pH5.2)的70%乙酸洗滌沉淀,用自動(dòng)微量移液器盡可能將乙醇吸盡, 隨后于室溫放置幾分鐘,晾干沉淀。切勿抽干沉淀,因?yàn)楦傻暮怂岢恋砗茈y溶解。
4)每個(gè)直徑為90mm的培養(yǎng)皿或每107細(xì)胞加200μl 50mmol/L Tris.Cl( pH7.8)1mmol/L EDTA(pH8.0)溶液重溶沉淀。
5)分別按10mmol/L和0.1mmol/L的深度加MgCl2和二硫蘇糖醇(DTT),然后分別按1000單位/或10mmol/L 的終深度加臺(tái)盤RNA酶抑制劑或氧釩核苷復(fù)合物。
6)加入無(wú)RNA酶的胰DNA酶I至終濃度為2μg/ml,混勻,于37℃溫育60分鐘。
7)分別按10mmol/L和0.2%的終濃度加EDTA和SDS。
8)用等體積酚:氯仿抽提1次。
9)于室溫以5000g離心10分鐘使水相與有機(jī)相分相, 將水相吸至另一個(gè)離心管內(nèi),加3mol/L乙酸鈉(pH5.2)至終濃度為0.3mol/L,加2.5倍體積用冰預(yù)次的乙醇,充分混勻,冰浴放置2小時(shí)。
10)用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘沉淀RNA。
11)吸出所有的乙醇,將打開管蓋的離心管在實(shí)驗(yàn)臺(tái)放置幾分鐘,讓最后殘存的痕量乙醇揮發(fā)干凈。
12)用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加500μl乙醇,于-70 ℃貯存?zhèn)溆;厥誅NA時(shí),只須取出1小份貯存液,加入3mol/L乙酸鈉(pH5.2 )至終濃度為0.3mol/L,充分混勻,用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。
三注意事項(xiàng)
1.測(cè)定最終所得溶液的OD260值可以確定RNA的濃度。取10μl乙醇/TE混合液[步驟13)]離心沉淀RNA,以400水重溶, 測(cè)定OD260 值, OD260=1的RNA溶液每毫升約含40μg RNA。
2.如果需要,可用oligo(dT) -纖維素層析法從所制備的細(xì)胞總RNA中純化無(wú)寡脫氧核糖核苷酸污染的mRNA或購(gòu)買試劑盒進(jìn)行mRNA的純化。
3.某些情況下(例如從感染了DNA病毒或用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中制備RNA時(shí)),必須從細(xì)胞總RNA中去除寡脫氧核核苷酸。否則,當(dāng)用這種RNA構(gòu)建cDNA庫(kù)或進(jìn)行引物延伸反應(yīng)時(shí)應(yīng)會(huì)出問(wèn)題, 反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中法染的模板DNA片段可能會(huì)與RNA雜交而充當(dāng)引物,從而導(dǎo)致物定mRNA5'末端定位的錯(cuò)誤或產(chǎn)生截短的cDNA克隆。
a)步驟12后,加200μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),用自動(dòng)微量移液器反復(fù)吹吸,以重懸核酸沉淀,將懸浮液移至另一個(gè)滅菌的微量離心管內(nèi)。
b)用微量離心機(jī)于室溫以12 000g離心10分鐘,RNA沉于管底,而絕大部分寡脫氧核糖核苷酸仍在上清中。
c)棄上清液,用200μl TE(pH7.6)重溶沉淀。加入20μl 3mol/L乙酸鈉(pH5.2),分混勻,加入550μl用冰預(yù)冷的乙醇。混勻溶液, 在冰上驟冷30分鐘。用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離主10分鐘,以回收RNA。小心吸出上清。d)棄上清液,用300μl TE(pH7.6)重溶沉淀,加1ml乙醇,-70℃貯存?zhèn)溆谩?BR>回收RNA時(shí),只需取出1小份貯存液,加3mol乙酸鈉(pH5.2 )至終濃度為0.3mol/L充分混勻,用微量離心機(jī)于4℃以12 000g離心5分鐘即可。如需去除氧釩核糖核苷復(fù)合物,用含0.1%羥喹啉的苯酚[用0.01mol/L Tris.Cl(pH7.8)平衡]將RNA終溶液抽提數(shù)次即可。
4. 對(duì)大多數(shù)細(xì)胞株來(lái)說(shuō), 一個(gè)直徑90mm 培養(yǎng)甲中培養(yǎng)的RNA收率為100-200μg。