酶在食品工業(yè)中得到了廣泛的應用,它是一種特異性的生物催化劑,在溫和的溫度和ｐＨ下發(fā)生反應。它們一旦從植物、動物和微生物中分離出來,就被認為在自然條件下是一種無毒的食品組分,同時被消費者認為是優(yōu)于化學合成物質(zhì)的食品加工助劑。應用酶制劑一般可以降低能耗,提高食品的質(zhì)量和安全性,為農(nóng)產(chǎn)品的應用開發(fā)提供了一條新的途徑。
漆酶由于在紡織、造紙工業(yè)上的應用而被廣泛研究,漆酶是一種含銅的多酚氧化酶(ＥＣ1 10.3 2),能夠氧化多酚類,含甲氧基的取代酚類、二胺和其它一些化合物,但是它不能象酪氨酸酶一樣氧化酪氨酸。圖1列出了典型的漆酶反應,苯酚經(jīng)一個電子氧化形成一個自由基,進一步氧化形成醌類,當有自由基產(chǎn)生時醌類能夠進一步聚合。漆酶可以從細菌、真菌和植物中得到,漆酶在葡萄酒、果汁和啤酒生產(chǎn)中存在著潛在的應用價值。
1 在葡萄酒中的應用
葡萄酒的穩(wěn)定性是漆酶在食品工業(yè)中的一個主要應用。葡萄汁和葡萄酒是一種復雜的混合物,它含有不同的化合物,如乙醇、有機酸、鹽類和酚類。乙醇和有機酸對葡萄酒芳香味有一定的作用,而葡萄酒的色澤和味道則特別依賴于在不同類型的葡萄酒中存在的酚類化合物。在葡萄酒中發(fā)現(xiàn)許多種酚類化合物。在所有的葡萄酒中都存在著不同數(shù)量苯乙烯酸衍生物和兒茶酚,而玫瑰紅和紅葡萄酒則以花色素為特征,葡萄中主要的色澤來源是錦葵色素,它是一種配糖物單體,在葡萄酒中酚類化合物的百分含量和組成依賴于生產(chǎn)過程中的許多變化因素。新鮮葡萄酒的感官特性從生產(chǎn)至消費都應該保持不變,換句話說,它至少在第一年的貯存期內(nèi)應有足夠的穩(wěn)定性,在之后發(fā)生的一系列復雜的反應中,多酚類起著重要的作用,葡萄汁和葡萄酒在鐵、銅和酶的催化作用下發(fā)生了氧化反應,這包括醛類、氨基酸和蛋白質(zhì)引起的混濁、色澤變深及芳香味和風味的改變,這種氧化現(xiàn)象被命名為“馬德拉群島現(xiàn)象”。為了阻止在葡萄酒中發(fā)生的脫色作用和風味的改變,已經(jīng)采用了不同的方法,如用聚乙烯吡咯烷酮(ＰＶＰＰ)去除酚類物質(zhì),用二氧化硫阻斷氧化作用以及其它的一些方法。在葡萄汁中去除多酚類應該有選擇性,要避免葡萄酒的感官特性發(fā)生不希望的變化,在“馬德拉群島現(xiàn)象”過程中可以用酶作為選擇性的物理化學吸附劑,這些多酚類物質(zhì)在酶催化下發(fā)生氧化、聚合,然后通過澄清的方法把它除去,為此目的而研究的一種酶就是漆酶。
這種處理手段具有專一性,并且它對葡萄酒的特性沒有劇烈的作用,作為一種溫和的技術(shù)而引起人們的興趣。在葡萄酒中用漆酶來去除多酚類需要一些必要的條件,如適宜的ｐＨ(約2.5～4.0)、酸性緩沖介子和以亞硫酸鹽作為可逆抑制劑以及其它的條件。有許多文獻報導,在葡萄酒中使用漆酸酶能夠提高它的穩(wěn)定性。來自于多孔屬雜色真菌的突變異種漆酶(最適ｐＨ2.7)在溶液中處理3ｈ能夠去除70%的兒茶酚和90%的花色素。漆酶作用于黑色的葡萄汁能夠去除50%的總多酚類,通過ＨＰＬＣ分析經(jīng)酶處理和沒有經(jīng)酶處理的葡萄汁,可以看出這種漆酶作用的有效性。這種方法在作用的專一性和穩(wěn)定性方面優(yōu)于物理化學處理方法。在葡萄酒中使用漆酶使葡萄酒穩(wěn)定性好、風味佳。結(jié)果顯示在葡萄灑中使用來源于多孔真菌的漆酶作為澄清劑,接著添加硅藻土溶液或者熱處理,最后通過超濾的方法去除氧化產(chǎn)物和酶蛋白是可行的。Ｚａｍｏｒａｎｉ在1989年用來自于加州的葡萄生產(chǎn)葡萄酒,在此過程中比較了丹寧酸酶、酚酶、漆酶或花色苷酶的作用,結(jié)果表明漆酶在去除多酚類時的效果優(yōu)于其它的酶類,但作者提醒必須同時使用硫磺處理、澄清劑處理和過濾以去除氧化產(chǎn)物,用以上方法(漆酶加硅藻土溶液)處理的葡萄酒時加入二氧化硫和不加入二氧化硫的澄清方法比較,流程如圖2所示,證明漆酶的使用是有效的,它優(yōu)于或至少相當于傳統(tǒng)的處理方法。感官分析證實葡萄酒使用漆酶和硅藻土溶液或者二氧化硫處理,在感官性質(zhì)上有較強的抵抗“馬德拉群島現(xiàn)象”的作用。在葡萄酒發(fā)酵前處理中,與傳統(tǒng)的澄清劑如蛋白質(zhì)和聚乙烯吡咯烷酮相比,漆酶具有潛在的作用效果。在用漆酶和不用漆酶的情況下,評價雷司令葡萄酒的多酚含量、色澤、混濁穩(wěn)定性和感官質(zhì)量,結(jié)果顯示使用漆酶處理制作的葡萄酒質(zhì)量較好,表明在使用漆酶的情況下,添加很少或者不添加二氧化硫可以生產(chǎn)出穩(wěn)定和高質(zhì)量的葡萄酒。用(5～20)單位/ｍｌ的漆酶添加到葡萄汁中,然后過濾(用或者不用聚乙烯吡咯烷酮)或者澄清(用斑脫土或白明膠加硅藻土溶液或亞硫酸鹽),結(jié)果表明使用酶處理為將來的研究提供了一個很好思路。
用漆酶處理葡萄酒的最初研究也證明這種酶在去除酚類化合物時有著巨大的潛在作用,可以從溶液中去除90%以上的阿魏酸和34%的酚酸。葡萄壓榨→分離葡萄汁→酶處理(硅藻土加入)→傾析(加二氧化硫)→離心→過濾→酶鈍化→煮沸圖2 以漆酶處理生產(chǎn)葡萄酒工藝流程圖到目前為止,漆酶還不允許作為食品添加劑使用(ＪＥＣＦＡ,ＦＡＯ/ＷＨＯ),這種酶以固定化酶的形式已經(jīng)在葡萄酒的生產(chǎn)中應用,但必須保證它最終從葡萄汁中除去并再利用。來源于葡萄孢屬灰質(zhì)的漆酶以物理和化學的方法固定在有機和無機基質(zhì)上,測試其對溫和的溶液、葡萄汁和葡萄酒中酚類的去除效果。通過吸附和共價連接將漆酶固定在分子篩和硅膠和戊二醛上,結(jié)果它可以使溶液、葡萄汁和葡萄酒中兒茶酚濃度顯著降低,并且酶可以再利用五次以上,將漆酶固定在瓊脂糖活性基質(zhì)上,并測試其在兒茶酚溶液和雷司令葡萄酒中的作用效果,固定化酶緊密排在不同尺寸的色譜中,用空氣、Ｎ2和02平衡,溶液以不同流速通過反應器,收集洗脫樣品并用聚乙烯吡咯烷酮處理,結(jié)果顯示,流速越低脫酚作用越是顯著,但色澤也加深。以固定化漆酶處理的葡萄酒較穩(wěn)定,酶可再利用八次以上,只要貯存在適宜的條件下其活性在六個月后沒有降低。當將漆酶以共價鍵固定在不同的多糖體上,其活性可以保留51%～63%,以它處理葡萄汁和葡萄酒,酚類的含量降低。以瓊脂糖凝膠4ＢＥｐｉ-ＩＤＡ-Ｃｕ2+成功地將漆酶固定化,并能夠去除酚類化合物,這些結(jié)果都證明了固定化漆酶在葡萄酒中的潛在應用。
近幾年來,證明適度飲用紅葡萄酒對人類健康有好處。研究人員已經(jīng)證實紅葡萄酒中多酚類物質(zhì)具有抗氧化特性,然而對每種化合物的專一性作用人們知道的很少,因此分析漆酶和葡萄酒中重要化合物的相互作用是非常必須的。據(jù)報道,用漆酶處理紅葡萄酒,證明漆酶主要對有抗氧化特性酚類化合物起作用,然而,用同樣的漆酶處理白葡萄酒,總酚類含量顯著降低,而不是主要作用于抗氧化多酚類,因此用漆酶處理白葡萄酒,總酚類含量顯著降低,而不是主要作用于抗氧化多酚類,因此用漆酶處理白葡萄酒是可行的。另外,通過篩選得到了漆酶的同功酶,它可以使紅葡萄酒中的酚類化合物含量降低,而且主要是使非氧化性多酚類含量下降。
2 在水果汁中的應用
自然產(chǎn)生的酚類物質(zhì)和它們的氧化產(chǎn)物是天然飲料的重要成分,對飲料的色澤和風味有一定的貢獻。酶類的應用,特別是那些能夠降解多糖和蛋白質(zhì)的酶類,在果汁的提取和穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要的作用。對于蘋果汁和葡萄汁,認為酚類的過度氧化對產(chǎn)品的感官質(zhì)量是有害的。因此,測量天然飲料中的酚類含量對于充分地描述產(chǎn)品的感官品質(zhì)和作為貯存穩(wěn)定性的指示劑是非常必要的。通過漆酶來測定飲料中酚類含量,對于蘋果汁,在酶分析和Ｆｏｌｉｎ-Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ分析總酚類含量間存在著一種線性關系,酶分析法對于預測天然飲料的穩(wěn)定性是有幫助的。啤酒、葡萄酒和澄清果汁的混濁和沉淀是由一些不同的原因引起的,但是最常見的是蛋白質(zhì)和多酚的相互作用,所說的穩(wěn)定性好的飲料就是延緩蛋白質(zhì)和多酚發(fā)生作用而引起的混濁。阻止水果汁的物理化學變質(zhì)是關系到它的生產(chǎn)和流通系統(tǒng)以及消費者對產(chǎn)品內(nèi)在品質(zhì)認識的一個主要問題,眾所周知,由酶和化學物質(zhì)引起的褐變是飲料質(zhì)量的主要問題,各種前處理和后處理都要盡量避免水果汁的后混濁和變色。為了使飲料穩(wěn)定,廣泛采用的傳統(tǒng)處理方法是用白明膠、班脫土、硅膠和聚乙烯吡咯烷酮處理,各種酶處理方法已經(jīng)被建議用于水果汁的穩(wěn)定,漆酶就是其中之一。漆酶與超濾聯(lián)用,不需要額外增加澄清劑能夠生產(chǎn)出穩(wěn)定澄清的蘋果汁,Ｓｔｕｔｚ在1993年也證明使用漆酶和超濾,能生產(chǎn)出穩(wěn)定、澄清的果汁而不會增加成本。使用漆酶與不同的方法相配,如巴氏殺菌、傳統(tǒng)澄清劑(白明膠和硅酸鹽)、過濾或超濾,證明使用漆酶與超濾與傳統(tǒng)的維生素Ｃ和亞硫酸鹽處理相比,提高了果汁色澤和風味的穩(wěn)定性。
3 在啤酒中的應用
啤酒產(chǎn)品在包裝時還是澄清的,但在長時間的貯存過程中都有形成混濁的傾向,這是釀造行業(yè)的一個永久的問題。啤酒的貯藏期依賴于許多因素,如溫度、形成混濁的內(nèi)在潛力和氧氣含量等。在啤酒中,自然產(chǎn)生的少量的花色素前體多酚類常常使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀,這是一般混濁形成的主要原因,這種現(xiàn)象常常表現(xiàn)為冷混濁,即在低溫時產(chǎn)生混濁物在室溫或更高溫度時又溶解,這一般歸因于氫鍵和脯氨酸的疏水相互作用。在后階段酚環(huán)被蛋白質(zhì)疏水基的親核取代也會產(chǎn)生永久的混濁現(xiàn)象,即使溫度升高混濁物也不會溶解。傳統(tǒng)上,過量的多酚類是用不溶解的聚乙烯吡咯烷酮處理除去,由于聚乙烯吡咯烷酮具有很低的可生物降解性,要把它處理掉而不會對環(huán)境造成污染,這對于工人們來說是非常困難的。與傳統(tǒng)方法相比,多酚氧化酶(如漆酶)的使用提供了一個新的選擇,可以把漆酶添加到麥芽汁中。根據(jù)Ｍａｔｈｉａｓｅｎ1995年的報導,因為在最終的啤酒產(chǎn)品中,氧氣是不希望有的,因此在生產(chǎn)的最后階段加入漆酶,也許可以除去過多的氧氣從而增加產(chǎn)品的貯藏期,同時漆酶也可以除去仍然存在于啤酒中的多酚類,加入漆酶后與多酚形成的復合物可以采用過濾或其它的分離方法除去,除了漆酶外,也可以在發(fā)酵的啤酒中加入一定的聚乙烯吡咯烷酮,Ｒｏｓｓｉ等在1988年也證實了在啤酒的穩(wěn)定性方面漆酶的潛在應用。