國(guó)內(nèi)外對(duì)食品防腐劑的合成、篩選、抗菌性能和抗菌機(jī)理進(jìn)行了大量的實(shí)驗(yàn)研究。在食品中添加高濃度食鹽、食糖、醋(乙酸)、乙醇或化學(xué)防腐劑是人們保存食品的傳統(tǒng)方法。但這些小分子食品成分可降低水分活度,使菌體蛋白變性,并影響和改變細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu),其機(jī)理主要是使菌體脫水。由于添加量大,所以通常會(huì)掩蓋或破壞食品自然風(fēng)味。為尋找保持食品固有色、香、味的天然防腐劑進(jìn)行了長(zhǎng)期的研究。主要集中在研究開(kāi)發(fā)廣譜、高效、低毒、天然的食品防腐劑。
1 天然防腐劑的主要來(lái)源
1.1 植物性天然防腐劑
Knobloch(1998)等對(duì)植物芳香精油的抗菌能進(jìn)行了研究,其抗菌性能則基于抗菌劑在菌體細(xì)胞膜雙磷脂層中的溶解度;而精油中的類(lèi)萜類(lèi)降低
生物膜的穩(wěn)定性并干擾能量代謝的酶促反應(yīng)。佐藤昭子(1990)、馬慕英(1993)、席嶼芳等(1993)研究出大蒜、洋蔥、生姜汁液中辛辣組份可抗青、綠霉菌。Kyung和Fl℃rning(1994)發(fā)現(xiàn)不含辛辣成分的白菜汁液在酸性條件下對(duì)乳酸菌有一定抑制作用。Hoffmann等(1992)曾報(bào)道植物糖苷也有抗真菌活性。日本Muroi和Kubo等人發(fā)現(xiàn)蘋(píng)果中最有效的抗菌活性物質(zhì)是己稀醛,綠茶中是nero2ledol,腰果中是漆樹(shù)酸。
1.2 動(dòng)物性天然防腐劑
近年來(lái),人們發(fā)現(xiàn)經(jīng)細(xì)菌、疫苗、某些化學(xué)物質(zhì)及超聲波誘導(dǎo)處理后,昆蟲(chóng)體液內(nèi)產(chǎn)生一些殺菌的物質(zhì),其中有一類(lèi)由數(shù)十個(gè)氨基酸殘基組成,稱(chēng)為抗菌多肽。姜明等也從柞蠶中誘導(dǎo)出抗菌肽,在pH3~6,濃度2%以上時(shí),殺菌速度大于大腸桿菌增殖速度,其作用機(jī)理是殺菌。在食品領(lǐng)域研究最多的則是昆蟲(chóng)抗菌多肽(Cecropin)。
1.3 微生物防腐劑
用發(fā)酵法生產(chǎn)溶菌酶作為食品防腐劑是成功先例Nakamura等人采用酶修飾法先后合成了溶菌酶)環(huán)糊精和溶菌酶)半乳甘露聚糖,這些糖蛋白抗菌活性比溶菌酶更高,還具有良好的乳化性能。Ibrahim等合成了脂�；芫�,其抗菌性依脂肪酸烷鏈增長(zhǎng)而提高。Norman(1994)發(fā)現(xiàn)乳酸鏈球菌肽(nisin),枯草桿菌素(subtilin)等微生物抗菌肽中含有的稀有氨基酸及環(huán)肽結(jié)構(gòu)是抗菌活性的原因所在。
2 天然肽類(lèi)防腐劑的研究
在天然防腐劑中,有一大類(lèi)屬肽類(lèi)防腐劑,由于其安全無(wú)毒害,且對(duì)人體有一定營(yíng)養(yǎng)保健作用而受到人們廣泛關(guān)注,成為防腐劑的研究熱點(diǎn)。
2.1 溶菌酶
溶菌酶Lysozyme是一種專(zhuān)門(mén)作用于細(xì)胞壁的水解酶,存在于人的唾液、眼淚、蛋清、哺乳動(dòng)物乳汁、植物和微生物中。它對(duì)人體安全無(wú)毒,無(wú)副作用,且具多種營(yíng)養(yǎng)與藥理作用,所以是一種安全天然防腐劑。溶菌酶是一種比較穩(wěn)定的堿性蛋白質(zhì),在酸性下最穩(wěn)定。在pH3時(shí)能耐100℃加熱40min,在中性和堿性條件下耐熱性較差,pH7時(shí)100℃處理10min就失活。研究最多的雞蛋清溶菌酶由129個(gè)氨基酸殘基組成,具有4個(gè)二硫鍵,分子相對(duì)質(zhì)量為14000,最適pH為6~7,最適溫度為50℃。
前發(fā)現(xiàn)的微生物溶菌酶大體有以下5種。
(1)內(nèi)N)乙酰己糖胺酶,此酶可破壞細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中的B)1,4糖苷鍵。
(2)酰胺酶,能切斷細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖中NAM與肽/尾0之間的N)乙酰胞
壁酶)L)丙氨酸鍵。
(3)內(nèi)肽酶,使肽/尾0及肽/橋0內(nèi)的肽鍵斷裂。
(4)B)1,3、B)1,6葡聚糖和甘露聚糖酶,此酶分解酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁。
(5)殼多糖酶,分解霉菌細(xì)胞壁。因?yàn)楦锾m氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁幾乎全部由聚多糖組成,因此主要對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌起作用。
2.2 昆蟲(chóng)抗菌肽
抗菌肽的一個(gè)典型特征是在一個(gè)長(zhǎng)的疏水片段后面連有一個(gè)強(qiáng)堿性的N)端區(qū)域。昆蟲(chóng)抗菌肽(Cecropin)由37個(gè)氨基酸殘基組成,N端呈堿性,
帶正電荷,親水;C端酰胺化,中性或微酸性,不帶電荷或少量負(fù)電荷,疏水。5~12位和25~37位構(gòu)成2個(gè)螺旋區(qū)域。抗菌肽的抗菌機(jī)理是在微生物細(xì)胞膜上形成通道,引起細(xì)胞質(zhì)溢流。關(guān)于通道形成的具體過(guò)程有
不同的幾種假說(shuō),Chistensen等認(rèn)為通道的形成可分為3個(gè)步聚:
(1)抗菌肽分子通過(guò)靜電作用被吸附到膜表面;
(2)抗菌肽分子中的疏水尾巴插入細(xì)胞膜;
(3)抗菌肽分子的兩性分子A螺旋插入膜中,多個(gè)抗菌肽分子共同作用形成離子通道。而Fik等認(rèn)為抗菌肽作用于細(xì)胞膜時(shí),N端的兩親螺旋結(jié)合在膜表面,只有C端的疏水螺旋插入膜中,進(jìn)而形成離子通道。Clagu℃等認(rèn)為抗菌肽通過(guò)作用于膜蛋白,引起蛋白質(zhì)由凝聚失活,細(xì)胞膜變性而形成離子通道。
2.3 魚(yú)精蛋白
魚(yú)精蛋白是一種在魚(yú)類(lèi)精核中發(fā)現(xiàn)的聚陽(yáng)離子肽,有廣譜抑菌活性,能抑制枯草桿菌、巨大芽孢桿菌、地衣形芽孢桿菌等的生長(zhǎng),分子富含蛋白質(zhì)和精氨酸。
從分子組成上看,魚(yú)精蛋白不具有兩親性,因?yàn)榉肿又械?2個(gè)氨基酸中21個(gè)為精氨酸,由于其多為陽(yáng)離子、非兩親性質(zhì),而無(wú)法插入細(xì)胞膜內(nèi)而形成膜通道。魚(yú)精蛋白的作用機(jī)制是抑制線(xiàn)粒體電子傳遞系統(tǒng)中的一些特定成分,抑制一些細(xì)胞膜有關(guān)的新陳代謝過(guò)程。
魚(yú)精蛋白適用于較大pH范圍內(nèi)使用,在中性和偏堿性條件下防腐效果更好。目前應(yīng)用最廣的防腐劑多為酸型防腐劑,只在酸性條件下有效,而在中性乃至偏堿性的食品中使用,效果明顯下降。魚(yú)精蛋白的開(kāi)發(fā)使用就可拓寬防腐劑使用的pH范圍,而且不需調(diào)整對(duì)象食品的pH。魚(yú)精蛋白的熱穩(wěn)定性,使它可以與食品熱處理并用。而它的抗菌活性可受食品中無(wú)機(jī)鹽的影響,而略有下降,尤其是二價(jià)金屬離子影響較大,主要營(yíng)養(yǎng)成分蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)對(duì)魚(yú)精蛋白的抗菌活性影響較小,這使它在富含糖類(lèi)和蛋白質(zhì)類(lèi)的食品中應(yīng)用成為可能。但根據(jù)國(guó)外報(bào)道,從魚(yú)精蛋白的進(jìn)化特點(diǎn)考慮,在含核酸較多的食品或含酸性多糖類(lèi)較豐富的食品中其抗菌效果相對(duì)較低。
2.4 乳酸鏈球菌素
乳酸鏈球菌素(Nisin)是乳酸鏈球菌在變性乳介質(zhì)中發(fā)酵生成的一種小分子多肽抗菌物質(zhì),由34個(gè)氨基酸殘基組成,分子量為3510道爾頓,活
性分子常是二聚體或是四聚體。Nisin中含有5個(gè)不同于其它蛋白質(zhì)的二硫鍵(硫氨酸和甲硫氨酸),另外還含有脫氫丙氨酸(DHA),甲基脫氫丙氨酸(DHB)等不飽和氨基酸。
Nisin的溶解度和穩(wěn)定性與溶液的pH值有關(guān),pH值越低,穩(wěn)定性越高,溶解度也提高。如:pH2.5時(shí)溶解度為12%;pH5.0時(shí)下降到4%;在中性和堿性條件下幾乎不溶解,應(yīng)用時(shí)要先用0102N酸溶解,加入食品中。pH2.0時(shí)或更低的稀鹽酸中可以經(jīng)115.6℃滅菌而不失活,但在pH5.0滅菌時(shí)失活40%,pH61.時(shí)將喪失90%的活力。這種熱穩(wěn)定性與其分子中的5個(gè)橋密切相關(guān)。Nisin加入食品后,穩(wěn)定性大大提高,食品中的大分子小分子物質(zhì)對(duì)Nisin有防護(hù)作用。因此,用Nisin來(lái)防腐的食品必須具有穩(wěn)定的酸性。而Nisin與熱處理殺菌作用是互相促進(jìn)的,加入少量的Ni2sin(0124~10ppm)可以大大提高腐敗微生物的熱敏感性。同樣,熱處理也提高了細(xì)菌對(duì)Nisin的熱敏感性,可以降低熱處理強(qiáng)度,保證良好品質(zhì)。另外,輻射處理和Nisin相結(jié)合;山梨酸與Nisin配合使用等可以彌補(bǔ)抗菌譜的缺點(diǎn),而發(fā)揮廣泛的防腐作用。
人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Nisin的6種類(lèi)型,分別為A,B,C,D,℃和Z。其中NisinA,NisinZ兩種類(lèi)型的研究最活躍。二者性質(zhì)基本相同,僅在結(jié)上
有一個(gè)氨基酸差異,Nisin第27位氨基酸殘基是組氨酸(His),NisinZ則是天冬酰胺(Asn)。從分子水平上探尋Nisin的抑菌機(jī)理一直是研
究的熱點(diǎn)。Nisin作用的位點(diǎn)主要是細(xì)胞膜。Palm2eri等對(duì)Nisin存在下雙層脂膜電流和電勢(shì)測(cè)量后,證實(shí)了Nisin形成膜通道的能力。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)小分子和離子通過(guò)管道流失,更嚴(yán)重則導(dǎo)致細(xì)胞溶解而達(dá)到殺菌防腐目的。
Nisin不能抑制革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌,專(zhuān)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌,特別是細(xì)菌芽孢。Nisin對(duì)孢子的作用有兩點(diǎn)值得注意:
(1)大多數(shù)情況下,對(duì)細(xì)菌孢子的作用方式是抑制孢子萌發(fā)而不是殺死
孢子。它對(duì)于熱加工食品防腐的重要意義在于必須在整個(gè)貨架期中保持足夠的乳酸鏈球菌肽殘留量,以提供對(duì)任何存在孢子的連續(xù)作用;(2)另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是孢子越受到熱損傷,就變得對(duì)乳酸鏈球菌肽越敏感。如經(jīng)121℃熱處理3min后存活下來(lái)的孢子比未經(jīng)加熱損傷的孢子對(duì)Nisin敏感10倍以上。這也是Nisin特別適用于熱加工食品防腐保鮮
的重要原因。
GB2760-86規(guī)定,罐裝食品,植物蛋白食品最大使用量為0.2gPkg;乳制品、肉制品最大使用量為0.5gPkg;一般參考量為0.1~0.2gPkg。
3 天然肽類(lèi)防腐劑研究趨勢(shì)
3.1 應(yīng)用基因工程方法生產(chǎn)
天然肽類(lèi)防腐劑多為動(dòng)物體正常蛋白質(zhì),故安全性很高,而且像溶菌酶,魚(yú)精蛋白等對(duì)人體還有一定保健作用,所以是一類(lèi)值得大力開(kāi)發(fā)的食品防腐劑。但蛋清、魚(yú)類(lèi)精巢等原料的供應(yīng)量很有限,因而妨礙了這些防腐劑的廣泛使用。目前人們正嘗試通過(guò)基因工程在微生物中直接表達(dá)抗菌肽基因,但這可能造成縮主微生物自殺而不能獲得表達(dá)產(chǎn)物,以融合蛋白質(zhì)的形式表達(dá)抗菌肽基因,雖然可克服這一缺點(diǎn),但仍有表達(dá)產(chǎn)物少的問(wèn)題。
3.2 肽的分子改造
天然防腐劑與目前廣泛使用的化學(xué)防腐劑相比,抗菌譜窄,抗菌效果差。所以,人們?cè)噲D通過(guò)分子修飾來(lái)提高抗菌性能。例如對(duì)昆蟲(chóng)抗菌構(gòu)效關(guān)系的研究表明,螺旋與抗菌肽的活性密切相關(guān),改變兩性分子螺旋的螺旋度會(huì)影響抗菌肽的活性。如用螺旋度傾向高的氨基酸殘基代替螺旋傾向低的殘基,抗菌肽的活性將明顯提高,相反,降低抗菌肽兩性分子A螺旋度將導(dǎo)致抗菌活性的急劇下降,可見(jiàn)兩性分子螺旋在維持抗菌肽活性中起著重要作用。溶菌酶被咖啡酸共價(jià)修飾后,修飾產(chǎn)物可強(qiáng)烈抑制大腸桿菌等格蘭氏陰性菌的生長(zhǎng),大大加寬了溶菌酶的抗菌譜。溶菌酶被環(huán)糊精和半乳甘露聚糖修飾后,不僅抗菌活性穩(wěn)定,而且具有良好的乳化性能,加工性能大為增強(qiáng)。所以,抗菌肽類(lèi)分子的改造和設(shè)計(jì)已成為獲得新抗菌肽的主要途徑。
3.3 與其他防腐劑聯(lián)合使用
天然肽類(lèi)防腐劑常和其他添加劑配合使用增強(qiáng)其抗菌效果。例如螯合劑eDTA,eDTA可從革蘭氏陰性菌中部分除去含脂多糖的外層膜,因而降低了其對(duì)其他防腐劑的抗性。例如,溶菌酶、Nisin等一般只能作用于革蘭氏陽(yáng)性菌,但與eDTA配合使用時(shí)他們對(duì)革蘭氏陰性菌的抑制能力也大為增強(qiáng)。
4 結(jié)束語(yǔ)
隨著生活水平的不斷提高和對(duì)健康的日益關(guān)注,人們對(duì)防腐劑之類(lèi)的食品添加劑在安全性能上提出了更高的要求,因此,人們開(kāi)始把目光投向于天然防腐劑。它已成為食品領(lǐng)域一個(gè)重要研究課題,由于肽類(lèi)防腐劑所具有的安全無(wú)毒害,甚至對(duì)人體有一定營(yíng)養(yǎng)保健作用等優(yōu)點(diǎn),其研究開(kāi)發(fā)無(wú)疑是一個(gè)很有前途的重要課題,肽類(lèi)防腐劑具有廣闊的發(fā)展前景。