密度梯度是用以防止對流保持pH梯度,避免已分離物質(zhì)再混合的重要措施則由重溶液和輕溶液以梯度混合形成。用做密度梯度的溶質(zhì)應(yīng)具有以下條件:溶解度高,粘度低;密度大,得到的密度差不低于0.12克/厘米3,不與樣品蛋白質(zhì)起反應(yīng),不解離。最常用的是蔗糖(分析純),它對蛋白質(zhì)不僅無害還有保護作用。重溶液含蔗糖50%(W/V),這時柱上和柱下最大密度差為0.2克/厘米3,濃度太高則粘度過大適用。蔗糖在高pH值時會分解,影響pH梯度及pI值測定,這種情況下可改用甘油,也可用甘露醇,山梨醇,右旋糖酐等。
在測定未知蛋白時,可先采用pH3-10的載體,經(jīng)初步測定后改用較窄的以提高分辨率,在使用pH7以上或以下范圍時,因缺少中性載體,在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區(qū)帶,純水的電導(dǎo)極低,必須避免此現(xiàn)象。凡使用離開中性的pH范圍的載體時應(yīng)加入相當(dāng)于0.1載體量的pH6-8或pH3-10的載體。在用pH低于3的范圍時,可加有機酸如一氯醋酸,二氯醋酸,甲酸,乙酸,pH離于10時,可補加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導(dǎo)較低,可以與蔗糖密度梯度互相補償,蔗糖濃度高時電導(dǎo)低,所以可把pH6電導(dǎo)低部位放在柱上部,也就是用pH6以下范圍時,陰極在上,而用pH6以上范圍時,陽極在上方。
電聚焦有高的分辨力,一般樣品不需提純,分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例:如大量提純蛋白質(zhì),則應(yīng)預(yù)先初步提純。有些物質(zhì)(如核酸)聚焦時會沉淀,應(yīng)預(yù)先除去。蛋白質(zhì)應(yīng)不含鹽,因鹽濃度高電流大,易發(fā)熱,而且鹽離子遷移至兩極產(chǎn)生酸堿,占據(jù)了分離的有效部位。加樣體積不受限制,最高可達(dá)80-85毫升。 等電點聚焦的分離容量受下列幾個因素影響:聚焦后每一區(qū)帶的蛋白量取決于密度梯度所能支持的蛋白質(zhì),提高密度可以提高分離容量;容量與區(qū)帶高度的平方成正比,降低電壓可使區(qū)帶變寬,提高容量,但分辨率降低,聚焦時間長,用窄的pH梯長范圍可以使區(qū)帶變寬,提高分辨率。用110毫升柱時,每一區(qū)帶蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)20-25毫克,由于粗蛋白樣品可分為很多區(qū)帶,所以總量可以加至幾百毫克;分離的容量與柱的橫載面成正比,用440毫克柱時,可加粗蛋白質(zhì)5克,每一區(qū)帶可達(dá)一克。
在測定未知蛋白時,可先采用pH3-10的載體,經(jīng)初步測定后改用較窄的以提高分辨率,在使用pH7以上或以下范圍時,因缺少中性載體,在聚焦過程中載體與電極之間在pH7部位就會形成純水區(qū)帶,純水的電導(dǎo)極低,必須避免此現(xiàn)象。凡使用離開中性的pH范圍的載體時應(yīng)加入相當(dāng)于0.1載體量的pH6-8或pH3-10的載體。在用pH低于3的范圍時,可加有機酸如一氯醋酸,二氯醋酸,甲酸,乙酸,pH離于10時,可補加胺使pH增加到11。載體在pH6附近電導(dǎo)較低,可以與蔗糖密度梯度互相補償,蔗糖濃度高時電導(dǎo)低,所以可把pH6電導(dǎo)低部位放在柱上部,也就是用pH6以下范圍時,陰極在上,而用pH6以上范圍時,陽極在上方。
電聚焦有高的分辨力,一般樣品不需提純,分析上可用來測定混合物中某一成分的相對比例:如大量提純蛋白質(zhì),則應(yīng)預(yù)先初步提純。有些物質(zhì)(如核酸)聚焦時會沉淀,應(yīng)預(yù)先除去。蛋白質(zhì)應(yīng)不含鹽,因鹽濃度高電流大,易發(fā)熱,而且鹽離子遷移至兩極產(chǎn)生酸堿,占據(jù)了分離的有效部位。加樣體積不受限制,最高可達(dá)80-85毫升。 等電點聚焦的分離容量受下列幾個因素影響:聚焦后每一區(qū)帶的蛋白量取決于密度梯度所能支持的蛋白質(zhì),提高密度可以提高分離容量;容量與區(qū)帶高度的平方成正比,降低電壓可使區(qū)帶變寬,提高容量,但分辨率降低,聚焦時間長,用窄的pH梯長范圍可以使區(qū)帶變寬,提高分辨率。用110毫升柱時,每一區(qū)帶蛋白質(zhì)含量最高可達(dá)20-25毫克,由于粗蛋白樣品可分為很多區(qū)帶,所以總量可以加至幾百毫克;分離的容量與柱的橫載面成正比,用440毫克柱時,可加粗蛋白質(zhì)5克,每一區(qū)帶可達(dá)一克。