1. 檢測的最低分析物濃度為檢測系統(tǒng)的分析靈敏度或稱檢測限。這個濃度限值對毒檢驗在法庭上特別重要,希望通過檢測知道樣品中究竟有無藥物,這是很關(guān)鍵的。另外,腫瘤標(biāo)志物及許多特定蛋白應(yīng)該有一個可檢測的最低濃度或某個量;如:前列腺特異蛋白(PSA),這是病人治療后監(jiān)視復(fù)發(fā)的重要信息;長期以來,臨床對報告的前列腺特異蛋白有意義的最小量要求予以明確。核酸檢測報告的陰、陽性也要求說明,能檢出的最小拷貝的核酸量相當(dāng)于多少病毒。因此,確定檢測系統(tǒng)的可報告低限是重要的分析性能。
2. 當(dāng)前,檢測限術(shù)語混亂。廠商使用各種詞語,如:靈敏度(sensitivity),分析靈敏度(analyticalsensitivity),最小檢測限(minimum detection limit),功能靈敏度(functional sensitivity),檢測限度(limit of detction)定量限度(limit of quantitation)等。迄今尚無標(biāo)準(zhǔn)定義,所以有必要了解每個詞語的實際含義和確定這個含義的實驗方式,怎樣處理數(shù)據(jù),怎樣由數(shù)據(jù)作出估計,以及這個估計對該檢驗的醫(yī)學(xué)應(yīng)用是否有用。以下介紹的分析靈敏度分為具有定性含義的檢測低限,和具有定量含義的生物檢測限及功能靈敏度。
二、 檢測低限(Lower Limit of Detection,LLD)
每次檢測,總是做一個空白樣品。檢測方法常以空白響應(yīng)量校準(zhǔn)至零點,再檢測各個檢測樣品的反應(yīng)響應(yīng)量。這些樣品的反應(yīng)響應(yīng)量在扣除了空白樣品響應(yīng)量后,是分析物的對應(yīng)響應(yīng)量。但是,空白響應(yīng)量也有波動。若重復(fù)多次作空白檢測,以空白(響應(yīng)量)均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示這些空白均值的離散程指標(biāo)。在確定方法性能或繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時,常常以空白均值表示空白響應(yīng)量大于或小于空白均值,各有50%的可能性。當(dāng)空白響應(yīng)量小于空白均值,對同一個樣品檢測響應(yīng)量(未扣除空白響應(yīng)量),似乎反映分析物要多一點,檢測方法好象靈敏些。當(dāng)空白響應(yīng)量大于空白均值,似乎原先可以檢測出來的分析物現(xiàn)在測不出了。因此,檢測方法必須說清楚:究竟怎樣才算是可檢測出來的分析物量?標(biāo)準(zhǔn)曲線從零開始,是不是報告的分析物量 可以從零開始?這就是檢測低限要回答的問題。統(tǒng)計說明,如果空白響應(yīng)量的波動服從正態(tài)分布規(guī)律:各個單次檢測的空白響應(yīng)量x空白有95%的可能性為:
—2.s空白≤x空白≤ —空白 2.s空白
即:∣x空白- 空白∣≤2.s空白
其中較空白均值小的一半會使分析物更易檢測出來,這不是檢測不出,不必考慮.若有一個檢測響應(yīng)量較空白響應(yīng)量均值大2s空白,仍然認(rèn)為是空白響應(yīng)量的可能性只有5%;有95%的可能性屬于樣品內(nèi)有分析物形成的檢測響應(yīng)檢測響應(yīng)量;它較空白均值差2s空白
以上。同理,響應(yīng)量較空白均值相差3s空白以上的,還認(rèn)為是空白響應(yīng)量的可能性僅0.3;而有99.7%的可能性是樣品內(nèi)有分析物形成的響應(yīng)量.所以若檢測樣品的反應(yīng)響應(yīng)量較空白均值大的,但和空白均值相差2s空白或3s空白以下的,只能說這些響應(yīng)量是空白樣品單次檢測的響應(yīng)量,樣品沒有分析物,或者表示:分析物量為零.超過2s空白或3s空白的響應(yīng)量才認(rèn)為樣品中真的含有分析物.
檢測低限定義為樣品單次檢測可以達(dá)到的檢測響應(yīng)量對應(yīng)的分析物量。檢測系統(tǒng)或方法對小于或等于檢測低限的分析物量只能報告“無分析物檢出”。通常估計95%或99.7%的兩種可能性:
95% 可能性:LLD= 空白 2.s空白
99.7% 可能性:LLD= 空白 3.s空白
要注意的是,直接讀出濃度單位的檢測系統(tǒng)對低于零的檢測將報告零,其分布不是正態(tài)的,因此計算的均值和標(biāo)準(zhǔn)差不能如實表達(dá)檢測低限的真實情況.若檢測響應(yīng)可以用初始值表示,如:吸光度、熒光、等,此時s空白是有效的。所以應(yīng)使用初始值來計算均值和標(biāo)準(zhǔn)差,然后再轉(zhuǎn)換成濃度單位。
三、 生物檢測限度(Biologic Limit of Detection,BLD)
大于檢測低限的響應(yīng)信號說明這個樣品內(nèi)有分析物,但是方法還不能正確報告定量結(jié)果。因為在這樣低的濃度或其他量值范圍內(nèi),單次檢測樣品的反應(yīng)響應(yīng)量重復(fù)性較差。那么在多少檢測響應(yīng)量時才能較好地報告定量結(jié)果呢?現(xiàn)介紹兩種方式:生物檢測限度和功能靈敏度。原則上,對多個近于檢測限濃度的樣品(肯定不是空白樣品)作重復(fù)檢測,對扣除了空白響應(yīng)量后的樣品檢測響應(yīng)量以均值和標(biāo)準(zhǔn)差歸納。按正態(tài)分布規(guī)律,單次檢測樣品具有的響應(yīng)量有95%或99.7%的可能性與不檢測響應(yīng)量均值相差2或3倍的響應(yīng)量標(biāo)準(zhǔn)差。較均值還大的單次響應(yīng)量肯定沒問題;但是較均值小的那些單次響應(yīng)量,若和檢測低限(空白響應(yīng)量上限)交叉,說明檢測方法還不能單憑一次檢測區(qū)分出這是空白還是有分析物。因此,這些樣品檢測響應(yīng)量的95%或99.7%單次檢測量最低值也較檢測低限(LLD)大,這樣就可保證樣品在任何情況下,單次檢測響應(yīng)量一定不是空白的響應(yīng)量;這個樣品具有的分析物濃度可以定量地報告出來.在多個近于檢測限的樣品中,符合這樣條件的最低分析物濃度(或其他量值)就是檢測系統(tǒng)或方法的生物檢測低限.
生物檢測低限定義為:以檢測低限加2或3倍檢測限樣品標(biāo)準(zhǔn)差的方式,確定檢測系統(tǒng)或方法可定量報告分析物提取低濃度或其他量值的限值。
生物檢測低限(BLD)的具體度量方式為:
95% 的可能性:BLD=LLD 2s檢測限樣品
99.7%的可能性: BLD=LLD 3.s檢測限樣品
本詞語較完善地表示實際樣品的檢測限度,如什么濃度才是零值或沒有分析物有差異.在證實廠商的BLD說明時,應(yīng)使檢測限樣品和濃度的廠商的說明相同。
四、 功能靈敏度(Functional Sensitivity ,F(xiàn)S)
功能靈敏度定義為:以天間重復(fù)CV為20%時對應(yīng)檢測限樣品具有的平均濃度,確定檢測系統(tǒng)或方法可定量報告分析物的最低濃度或其他量值的限值。為了估計FS,須用多個檢測限濃度來確定在低濃度處的精密度表現(xiàn),從中選擇具20%CV的濃度。在證實廠商的FS的明時,使用的檢測限樣品濃度應(yīng)和廠商的說明相同。
五、 實驗須考慮的因素
一般制備兩種不同類型的樣品。一個是“空白”樣品,即不含有分析物,分析物濃度為零。另一個是“檢測限”樣品,即含有低濃度的分析物。在有些場合下,需要制備幾份“檢測限”樣品。空白和檢測限樣品由檢驗方法作重復(fù)檢測。計算各自的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。不同的檢測限由空白和檢測限樣品數(shù)據(jù)計算出來。
1. 空白液:一份空白液用作空白,其他用于制備檢測限樣品。理想的空白液應(yīng)具有和檢驗的病人樣品相同的基體。但是,常使用檢測系統(tǒng)的系列標(biāo)準(zhǔn)品中的“零標(biāo)準(zhǔn)”作為空白。對某些項目,可使用術(shù)后無某疾病的病人樣品(如:前列腺腫瘤術(shù)后病人的無PSA血清)為空白樣品。
2. 檢測限樣品:在證實某方法的靈敏度性能時,對空白液加入分析物配制成檢測樣品,。加入的分析物量應(yīng)是廠商說明的檢測濃度。在建立檢測限度時,有必要制備幾份檢測限樣品,它們的濃度應(yīng)界于預(yù)期檢測限度高低一些的范圍內(nèi)。重復(fù)檢測數(shù):沒有具體規(guī)定,但常推薦做20次。符合臨床檢驗對重復(fù)檢測實驗的要求。廠商常推薦10次,為減少開支實驗室也常采納作10次
3. 實驗需要時間:如果主要從空白液的重復(fù)性了解檢測低限,常常就做批內(nèi)或短期實驗。如果主要從“檢測限”樣品的重復(fù)性了解定量的檢測限,推薦作較長時間的實驗,代表天間測定性能。實際就做10次檢測(10d)。
計算示例:
某酶標(biāo)法的甲狀腺球蛋白試劑盒的分析靈敏度實驗結(jié)果如下:
1. 用甲狀腺切除后恢復(fù)健康的病人血清為無甲狀腺球蛋白的空白血清。將純化的甲狀腺球蛋白加入該血清,并用空白血清作系列稀釋,組成0,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0ug/L的甲狀腺球蛋白樣品.
2. 空白血清作12次批內(nèi)重復(fù)測定;對其它系列樣品作天間重復(fù)測定,做了12d.記錄所有結(jié)果,列表如下:
表1 甲狀腺球蛋白分析靈敏度實驗結(jié)果
1. 檢測低限
空白”0”組的均值為0.098,標(biāo)準(zhǔn)差為0.0137。這里采用99.7%的可能性來計算檢測低限。如上所述:
LLD= 0 3s0,現(xiàn) 0=0.098,SO=0.0137,
∴ LLD= 0 3s0=0.098 3×0.0137=0.139
實際上,若以空白吸光度均值為檢測的起點0,那么有99.7%的可能性,每次只做一個空白時,出現(xiàn)最高的空白吸光度較該空白吸光度均值高0.0137的3倍,即0.041A。這些吸光度相當(dāng)于樣品具有的甲狀腺球蛋白即為本法的檢測低限。
其實,上述的實驗結(jié)果可以畫出該檢測系統(tǒng)在低濃度范圍的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上面所有的吸光度減去空白吸光度均值,然后求每組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。見表2。
現(xiàn)在0.25ug/L組減去空白后的吸光度均值為0.07625A.假定這段范圍內(nèi)甲狀腺球蛋白量和吸光度間呈線性.因此0.041A相當(dāng)于
0.25× 0.041 =0.13ug/L
0. 07625
所以本法的檢測低限為0.13ug.L
表2 甲狀腺球蛋白由檢測系統(tǒng)分析靈敏度計算
1、生物檢測限
由前述,空白血清如以現(xiàn)有的吸光度均值為準(zhǔn),有99.7%的可能性出現(xiàn)的空白吸光度可高到0.139A.0.25ug/L甲狀腺蛋白組減去空白后的吸光度均值為0.07625A,標(biāo)準(zhǔn)差為0.0253A;可推測,有99.7%的可能性出現(xiàn)最小的吸光度為0.07625 -3×0.0253A,即0.0019A;而空白吸光度減去空白吸光度均值可能有的最高值為0.0411A.這0.0019A在空白吸光度涉及的范圍內(nèi).因此0.25ug/L不是本法的生物檢測限。0.5ug/L的99.7%的最低吸光度0.025A(已減去空白),也在空白涉及的范圍內(nèi).1.0ug/L的99.7%的最低吸光度為0.0518A(已減去空白),在0.0411A之外,說明1.0ug/L的樣品吸光度有99.7%的可能性,一定大于空白的吸光度,能定量地報告結(jié)果。1.0ug/L為本法的生物檢測限.
3、功能靈敏底
從上面的表中可知,1.0ug/L組的重復(fù)檢測變異系數(shù)CV為19.3%,最接近20%.所以,本法的功能靈敏度為1.0ug/L.它也正好等于生物檢測限估計的限值.