1）基因組DNA Southern印跡的制備

預(yù)備

1．用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化基因組DNA樣品（10μg）。

2．進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。一般用0.7～1.0％的瓊脂糖凝膠分離基因組DNA，它在1～15kb的范圍內(nèi)有較好的分辨率，可選用TBE或TAE緩沖液。瓊脂糖凝膠電泳需在1V/cm的電壓下進(jìn)行，如果要分離片段大小相似的DNA帶，應(yīng)用較大的凝膠（20×25cm）。常用的標(biāo)準(zhǔn)品是由Hind Ⅲ消化的λDNA、Hae Ⅲ消化的ΦX174 DNA和100或1000bp的梯形圖譜。電泳完畢，將凝膠放在紫外透射儀上，并在凝膠旁放一尺子進(jìn)行拍照。當(dāng)把凝膠從盤內(nèi)移動(dòng)紫外透射儀時(shí)，小心不要將凝膠滑落或弄破。

Southern印跡的制備

1．將凝膠轉(zhuǎn)移至塑料盒內(nèi)。

2．加入至少4倍凝膠體積的0.25mol/L HCl使DNA脫嘌呤，置室溫?fù)u床溫育15min。這時(shí)凝膠上樣緩沖液中的溴酚藍(lán)應(yīng)變黃色，如果15min后仍呈藍(lán)色，應(yīng)再溫育5min。

3．小心地塑料盒內(nèi)HCl棄去，用蒸餾水漂洗凝膠一次。

4．加入至少4倍體積的變性緩沖液，置室溫?fù)u床溫育20min。

5．用新鮮緩沖液重復(fù)步驟4，小心棄去變性緩沖液，用蒸餾水稍加漂洗。

6．加入至少4倍體積的中和反應(yīng)緩沖液，置室溫?fù)u床溫育15min。

7．用新鮮緩沖液重復(fù)步驟6。

8．當(dāng)處理凝膠時(shí)，裁一張略大于凝膠的濾膜（硝酸纖維膜或尼龍膜），預(yù)先用蒸餾水將濾膜浸濕后用20×SSC浸泡至少15min。

9．安裝轉(zhuǎn)移裝置。在盤中加入印跡緩沖液（20×SSC），在緩沖液面作一平臺(tái)，比如可倒置一凝膠盤，上面蓋三張經(jīng)20×SSC飽和過的濾紙（Whatman 3MM），平臺(tái)兩側(cè)的濾紙應(yīng)浸泡在緩沖液中，用10ml的玻璃吸管在其表面小心滾動(dòng)以趕出所有氣泡，并將濾紙推平。

10． 倒數(shù)毫升20×SSC于濾紙表面，將凝膠面向下倒扣在濾紙上，小心趕出凝膠與濾紙間的氣泡，凝膠四周用膠布或塑料薄膜包裹以防緩沖液從凝膠周圍直接流至紙中（虹吸短路）。

11． 加數(shù)ml 20×SSC浸沒凝膠，表面覆以濾膜，確保凝膠與濾膜之間無(wú)氣泡。

12． 裁三張大小合適的3MM濾紙，用20×SSC浸濕后鋪在濾膜表面。

13． 放一疊干燥的吸水紙（印跡紙或紙巾）在3MM濾紙上（約5～8cm高）。

14． 置一玻璃板于吸水紙上，其上放一重約0.75～1kg的物體。

15． DNA轉(zhuǎn)移可進(jìn)行12～16h（如過夜），確保槽內(nèi)有足夠的20×SSC（1～3L）。

16． 毛細(xì)管虹吸轉(zhuǎn)移完畢，小心拆卸印跡裝置。將膜與凝膠一起轉(zhuǎn)移至干燥的濾紙上，凝膠在上，用軟鉛筆標(biāo)記凝膠和濾膜的加樣孔位置，撕去凝膠。

17． 用5×SSC漂洗雜交膜以去除瓊脂糖殘跡。

18． 將濾膜放在一張干燥的3MM濾紙上稍微晾干。

19． 固定DNA于濾膜上，若用硝酸纖維素膜，在80℃真空箱中烤2h；若用尼龍膜，將DNA面朝下暴露于紫外透射儀3～5min。

20． 這時(shí)的濾膜已可用于雜交，或貯存在4℃。硝酸纖維素膜需真空保存，尼龍膜需用塑料薄膜密封。

2）DNA印跡雜交

1．用5×SSPE浸滲DNA濾膜。

2．將浸濕的DNA濾膜放入塑料袋內(nèi)，袋的四邊密封并剪去一角。

3．從缺口處加入預(yù)雜交液（0.1ml/cm2），避免加入氣泡，將袋中的氣泡全部擠出，封口。

4．將塑料袋置水浴搖床中溫育，或夾在兩塊玻璃板中置65℃烤箱2～4小時(shí)，確保濾膜表面無(wú)氣泡。

5．在95℃ 10min使探針變性，立即置冰浴冷卻5min。

6．剪去雜交袋的一角，將預(yù)雜交液倒入15或50ml的Falcon試管中，將約10～20ng/ml（隨機(jī)引物標(biāo)記的）或50～100ng/ml（缺口平移法的）探針加到預(yù)雜交液或新鮮配制的雜交緩沖液中（如果打算用硫酸葡聚糖）。一般來說，106～107cpm/ml已足夠，輕輕混勻，用一次性的塑料移液管將雜交液加到塑料袋內(nèi)的濾膜上。

7．從開角處將雜交液袋內(nèi)的氣泡全部擠出，用紙巾吸去流出的少許雜交液，小心封口以防雜交液漏出。必要的話，可將此雜交袋套在另一塑料袋中以防放射性污染。

8．在65℃水浴搖床中溫育或夾在兩塊玻璃板中置烤箱烘烤12～16h。

9．雜交后，剪去雜交袋的一角，擠出雜交混合液倒入15或50ml的Falcon管中，小心不要使放射性溶液濺出。

10． 將雜交袋完全打開，用鈍頭鑷子將濾膜轉(zhuǎn)移至盤內(nèi)以便漂洗，立即用緩沖液1（2×SSC，0.1％SDS）洗濾膜。

11． 室溫下，用漂洗緩沖液1漂洗濾膜三次，每次5min。

12． 室溫下，用漂洗緩沖液2（0.25×SSC，0.1％SDS）漂洗濾膜兩次，每次5min。

13． 在65℃用預(yù)熱的漂洗緩沖液2洗膜1～3次，每次15min。在更換緩沖液之間，應(yīng)用蓋革計(jì)數(shù)器檢測(cè)滯留在印跡中心的放射性（將印跡中心所期望的特異性信號(hào)與印跡邊緣所期望的本底信號(hào)相比較）。

14． 充分漂洗后，將濾膜放在一張3MM的濾紙上稍微晾干，將潮濕的濾膜封在薄塑料袋內(nèi)或用塑料薄膜包裹。

15． 濾膜的放射自顯影：將印跡膜（封在塑料袋內(nèi)，DNA面朝上）放在X射線暗盒底部，其上放置（攝影的）膠片，增感屏常規(guī)貼在盒蓋內(nèi)面，關(guān)閉暗盒，在－70℃進(jìn)行放射自顯影過夜～兩周。