一般情況下，只要有克隆的探針，就不用寡核苷酸探針。在DNA序列未知而必須首先進行克隆以便繪制酶譜和測序時，也常應(yīng)用克隆�？寺√结樢话爿^寡核苷酸探針特異性強，復雜度也高，從統(tǒng)計學角度而言，較長的序列隨機碰撞互補序列的機會較短序列少，克隆探針的另一優(yōu)點是，可獲得較強的雜交信號，因為克隆探針較寡核苷酸探針摻入的可檢測標記基因更多。但是，較長的探針對于靶序列變異的識別能力又有所降低。對于僅是單個堿基或少數(shù)堿基不同的兩序列，克隆探針不能區(qū)分，往往雜交信號相當。這既是其優(yōu)點，又是其缺點。優(yōu)點是當用于檢測病原微生物時，不會因病毒或細菌DNA的少許變異而漏診，缺點則是不能用于點突變的檢測。這種情況下，通常要采用化學合成的寡核苷酸探針。

　　合成的寡核苷酸探針具有一些獨特的優(yōu)點：①由于鏈短，其序列復雜度低，分子量小，所以和等量靶位點完全雜交的時間比克隆探針短，如20nt的寡核苷酸探針在濃度為100ng/ml，靶序列為1～100pg、1kb片段或3×10-18~3×10-16mol/L時，達到最大程度的雜交只需10min，而用2kb的克隆探針在同樣條件下達到完全雜交則需16h。②寡核苷酸探針可識別靶序列內(nèi)1個堿基的變化，因為短探針中堿基的錯配能大幅度地降低雜交體的Tm值。③一次可大量合成寡核苷酸探針（1～10mg），使得這種探針價格低廉，與克隆探針一樣，寡核苷酸探針能夠用酶學或化學方法修飾以進行非放射性標記物的標記。盡管克隆探針較特異，但通過細心篩選序列和/或選擇相對長的序列（＞30nt）亦可設(shè)計出非常特異的寡核苷酸探針。最常用的寡核苷酸探針有18～40個堿基，目前的合成儀可有效地合成至少50個堿基的探針。下面是篩選寡核苷酸針的一些原則。

　�、匍L18～50nt，較長探針雜交時間較長，合成量低；較短探針特異性會差些。

　�、趬A基成分：G C含量為40%～60%，超出此范圍則會增加非特異雜交。

　�、厶结樂肿觾�(nèi)不應(yīng)存在互補區(qū)，否則會出現(xiàn)抑制探針雜交的“發(fā)夾”狀結(jié)構(gòu)。

　�、鼙苊鈫我粔A基的重復出現(xiàn)（不能多于4個），如-CCCCC-。

　　⑤一旦選定某一序更符合上述標準，最好將序列與核酸庫中核酸序列比較，探針序列應(yīng)與含靶序列的核酸雜交，而與非靶區(qū)域的同源性不能超過70%或有連續(xù)8個或更多的堿基的同源，否則，該探針不能用。

　　按上述原則選出的探針會增加成功的機會，選定后進行合成與標記，并摸索合適的雜交條件。方法是制備幾張點有特異靶DNA和不相關(guān)DNA的膜，各膜分別在不同溫度下與探針雜交，特異靶DNA雜交信號強而非特異DNA不產(chǎn)生任何雜交反應(yīng)的就是最適雜交溫度。在進行點突變檢測雜交的反應(yīng)時，洗膜條件和溫度物選擇往往更為重要。所選漂洗條件必需使野生型靶DNA與探針產(chǎn)生強的雜交信號而突變型靶DNA則不產(chǎn)生雜交信號，這可以通過逐漸提高洗膜溫度來完成。

　　寡核苷酸探針還有一個重要用途。在用于檢測單個堿基差異時尚可采用一種稱為寡核苷酸限制（oligonucleotide restriction）的技術(shù)。該技術(shù)只有在突變點位于某一限制性內(nèi)切酶識別位點時才有效。例如，鐮刀狀紅細胞貧血是因β珠蛋白基因的第6個寡碼子由GAG變成GTG，從而導致所編碼氨基酸由酪氨酸變成纈氨酸。突變的β-珠蛋白功能異常，稱作S珠蛋白，而野生型稱為A珠蛋白，其基因型分別為βS和βA。恰好突變點A→T位于Del I的識別序列CT－NAG之內(nèi)，這就為設(shè)計寡核苷酸限制實驗創(chuàng)造了條件。方法是合成一個長40個堿基的寡核苷酸探針，其5’末端距突變堿基有11個堿基，該探針與βA基因的非編碼鏈互補。將此探針的5’末端標記上32P。雜交方法采用液相雜交法，即在液相中將靶DNA變性解矗?緩笥胩秸臚嘶穡???詠惶濉Ｈ綈蠨NA為βA型，則兩條鏈完全互補，并產(chǎn)生Dde I的酶切位點；如待檢DNA為βS型，則所形成的雜交體中兩條鏈在突變堿基處不配對，從而不能被Del I所識別。用Del I消化雜交DNA，顯然βA會被切開而βS不被切開。βADNA雜交體被切開后，5’端探針序列因只有8個堿基，與雜交鏈結(jié)合不緊而解離，從而產(chǎn)生游離的5’端標記8核苷酸單鏈。不被切開的βS雜交體尚可被另一個限制酶Hinf I消化，該酶的識別位點緊靠Del I 識別位點上游。βS雜交DNA經(jīng)Hinf I消化后，將釋出探針DNA的5’末端3核苷酸小片段。βADNA雜交體因已無Hinf I識別序列，故而不能被Hinf I消化。這樣βA和βSDNA經(jīng)此寡核苷酸探針雜交和Del I及Hinf I消化后，分別產(chǎn)生游離的8核苷酸（8nt）和3核苷酸（3nt） 片段，它們可以經(jīng)電泳分離后進行放射自顯影而獲證實。藉此策略，可輕易將各種β珠蛋白突變型鑒別開，如純合野生型AA結(jié)果為僅有8nt片段，純合突變型SS則僅可檢出3nt片段，而雜合子AS型則兩種片段均存在。