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用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA制備siRNA庫

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

其他制備siRNA的方法都需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個最有效的siRNA。而用RNaseIII降解長片斷雙鏈RNA成為siRNAs庫就象制備一份混合有各種siRNAs“混合雞尾酒”, RNase III的完全降解產(chǎn)物(12—15bp)同樣可以誘導專一的基因沉默,效果與化學合成或者是酶法得到的siRNAs相當。該方法是選擇200—1000bp的靶mRNA,用體外轉(zhuǎn)錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA,然后用RNaseIII(或Dicer)酶在體外消化,得到一眾siRNAs“混合雞尾酒”。除掉沒有被消化的dsRNA,siRNA混合物就可以直接轉(zhuǎn)染細胞。由于siRNA混合物中有許多不同的siRNAs,通常能夠保證目的基因被有效地抑制。

主要優(yōu)點:

1. 可以跳過檢測和篩選有效siRNA序列的步驟,避免化學合成siRNA的昂貴費用,siRNA表達載體的繁瑣勞動,以及為找到一個有效的siRNA 序列所必經(jīng)的漫長的篩選過程,為研究人員節(jié)省時間和金錢(通常用RNAse III通常比用Dicer要便宜),是一種比較簡單粗放、快速、性價比很高的方法。

2. 可能引發(fā)非特異的基因沉默,特別是同源或者是密切相關的基因,F(xiàn)在多數(shù)的研究顯示這種情況一般不會造成影響。最近一篇關于RNase III制備的siRNAs和相關的RNA結(jié)合蛋白的文章同樣證實沒有非特異基因沉默的發(fā)生。在除了哺乳動物細胞以外的其他系統(tǒng)中,可以通過Dicer酶復合物消化長片斷RNA雙鏈,得到針對同一個靶基因多個位點的siRNAs群,從而特異的抑制目的基因的表達。這些結(jié)果提示存在某種適當?shù)臋C制來維護抑制反應的高度專一性。Ambion公司曾經(jīng)用它的SilencersiRNA Cocktail Kit(RNase III)試劑盒成功關閉幾個基因,包括c-fos, GAPDH, La, ß-actin, 和Ku-70。

3. RNase III能夠消化各種來源的雙鏈RNA。

4. RNase III 得到的12-15bpsiRNAs庫能夠非常有效的抑制基因的表達。在這個siRNAs庫中既有一些有效的siRNAs分子,也有很多無效的siRNAs部分。

5. 導入這種方法制備的siRNA庫,并沒有表現(xiàn)比用化學合成法制備特定的siRNAs更高的毒性或者是對基因表達的非特異效應。

因而,采用RNase III 制備siRNAs混合庫可以成為有別于傳統(tǒng)方法的制備siRNA的另一種好辦法。

適用:1.快速經(jīng)濟地研究某個基因功能缺失的表型

2.只需要運用RNAi 技術(shù)作為遺傳工具,快速得到RNA干擾結(jié)果,而無需詳細研究siRNA具體信息的研究人員
不適用:1.長時間的研究項目

2.需要一個特定的siRNA,特別是基因治療

 

 

 
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