多數(shù)的siRNA表達(dá)載體依賴RNA聚合酶III 啟動(dòng)子(pol III)中的一種，操縱一段45—50nt的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin RNA, shRNA）在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá),shRNA在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為siRNA，從而引發(fā)基因沉默或者表達(dá)抑制。這一類啟動(dòng)子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動(dòng)子和人H1啟動(dòng)子等。采用RNA pol III啟動(dòng)子的原因是由于它有明確的啟始和終止序列，總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開(kāi)始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止，并且轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在第二個(gè)尿嘧啶處被切下來(lái)，非常精確，而且還可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)更多的小分子RNA。轉(zhuǎn)錄出的RNA形成發(fā)卡樣結(jié)構(gòu)后，會(huì)在3’端形成2個(gè)突出的尿嘧啶，這類似于天然的siRNA,因而有利于雙鏈RNA誘發(fā)RNAi。要使用這類載體，需要訂購(gòu)2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈，退火后克隆到相應(yīng)載體的pol III 啟動(dòng)子下游。克隆的過(guò)程需要幾天的時(shí)間，也需要經(jīng)過(guò)測(cè)序以保證克隆的序列是正確的。
先在體外構(gòu)建能表達(dá)雙鏈RNA的載體，再將載體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)在細(xì)胞內(nèi)合成出雙鏈RNA，不但能增加有效轉(zhuǎn)染細(xì)胞的種類，而且在長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞株中，雙鏈RNA能夠長(zhǎng)期發(fā)揮阻斷基因的作用。
現(xiàn)在有多個(gè)報(bào)道說(shuō)通過(guò)質(zhì)粒表達(dá)siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達(dá)。當(dāng)這種帶有PolIII 啟動(dòng)子和shRNA編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，抑制范圍包括外源基因和內(nèi)源基因。
腺病毒是體內(nèi)轉(zhuǎn)基因的常用載體。Xia HaiBin等用腺病毒做載體，在體內(nèi)和體外表達(dá)dsRNA,并成功的阻斷了基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)了成體動(dòng)物的基因敲除。
最近多個(gè)廠家開(kāi)始研究逆轉(zhuǎn)錄病毒和其他病毒載體用于siRNA表達(dá)，其優(yōu)勢(shì)在于可以直接高效率感染細(xì)胞進(jìn)行基因沉默的研究，避免由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低而帶來(lái)的種種不便。
主要優(yōu)點(diǎn)：
1.是唯一可以進(jìn)行長(zhǎng)期研究的方法。雙鏈RNA只能短暫抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因表達(dá)，而具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA能夠增加阻斷基因表達(dá)的時(shí)間。在小鼠畸胎瘤細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞，C2C12細(xì)胞中，用長(zhǎng)鏈具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA有效的阻斷了報(bào)告基因的表達(dá)，在穩(wěn)定表達(dá)具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA的細(xì)胞株中，報(bào)告基因的表達(dá)被長(zhǎng)期的阻斷了。帶有抗生素標(biāo)記的載體可以在細(xì)胞中持續(xù)抑制靶基因的表達(dá)，持續(xù)數(shù)星期甚至更久。即使是對(duì)轉(zhuǎn)染帶有篩選標(biāo)記質(zhì)粒的細(xì)胞進(jìn)行瞬時(shí)篩選，也有助于富集帶質(zhì)粒的細(xì)胞。這也可以幫助解決一些難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于轉(zhuǎn)染效率低造成的問(wèn)題。
2.由于質(zhì)�？梢詮�(fù)制擴(kuò)增，相比起化學(xué)合成來(lái)說(shuō)，能夠顯著降低制備siRNA的成本。
適用：已知一個(gè)有效的siRNA序列，需要維持較長(zhǎng)時(shí)間的基因沉默，或者需要用抗生素篩選能表達(dá)siRNA的細(xì)胞。長(zhǎng)期研究。
不適用：篩選siRNA序列（其實(shí)主要是指需要多個(gè)克隆和測(cè)序等較為費(fèi)時(shí)、繁瑣的工作）。
