一、提取抗原蛋白
將提取RNA途中留存的樣品，加入150μl 100%酒精充分混勻，靜置5min(RT), 2000×g , 4℃離心5min, 吸取上清至新管中, 加入750μl異丙醇, 混勻, 靜置10min(RT), 12000×g, 4℃離心10min, 棄上清, 加入1ml 0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精重懸沉淀, 用加樣器打散沉淀, 混旋20~30秒, 靜置20min(RT) , 7500×g, 4℃離心5min, 棄上清 , 重新加入1ml 0.3mol/L鹽酸胍/95%酒精兩次, 重懸沉淀, 離心后棄上清, 加入100% 無(wú)水乙醇 1ml, 混旋1min, 靜置20min(RT), 7500×g, 4℃離心5min, 棄上清,真空干燥5min , 50μl 1%SDS溶解沉淀，用50℃熱水助溶，直至全部溶解。10000×g, 離心10min,去除沉渣。
二、蛋白定量
1. 取PBS、各樣品10 ul，加DW 990 ul
2. 取DW勻漿緩沖液、樣品稀釋液、系列牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度0.5 ml。
3. 向各管加入2.5 ml D試劑（A50ml＋B0.5ml＋C0.5ml A－2%[陳星云1] Na2CO3、0.1N NaOH，B－0.5%CuSO4，C－1%酒石酸鈉）混勻，靜置10分鐘。
4. 迅速加入酚試劑0.25ml，混勻 37℃ 水浴30分鐘。
5. 721分光光度計(jì)650 nm，比色，S0標(biāo)準(zhǔn)管調(diào)零。
6. 最后稀釋為4 ug /ul，加載樣緩沖液后，終濃度為2ug / ul，上樣量為30～80ug / 泳道。
三、電泳
1. make gel．
|
11%分離膠 12ml 兩塊膠 |
4%積層膠6ml兩塊膠 |
|
DW 4.36 ml |
DW 堵漏 3.66ml |
|
3M Tris 3.0 ml |
0.5M Tris 1.5 ml |
|
30%Arc 4.4 ml |
30%Arc 0.5 ml 0.78 ml |
|
10%SDS 0.24 ml |
10%SDS 60 ul |
|
10%APS 0.12 ml |
10%APS 20ul 30 ul |
|
TEMED 10ul |
TEMED 5ul 6ul |
2. 上樣前樣品處理：
樣品100℃、3分鐘、冷卻，900×g、離心30 S。
3. 通電電： 積層膠電泳電壓50V左右，分離膠電泳電壓90～110V。
4. 考馬斯亮藍(lán)染色： 1小時(shí)，1號(hào)脫色1小時(shí)，2號(hào)脫色2小時(shí)。
四、電轉(zhuǎn)印
1. 將濾紙NcM切成與凝膠尺寸大小，置于DM中浸透5分鐘，電轉(zhuǎn)液平衡15分鐘。
2. 轉(zhuǎn)移：用二張大濾紙貼于兩張多孔墊料，將NcM、膠夾于中間，在NcM與大濾紙之間墊小濾紙。NcM朝正極，20V恒壓轉(zhuǎn)移12小時(shí)。取下NcM雜交，凝膠染色看效果。
五、雜交
1. 取下NcM，做好標(biāo)記，dH2O沖洗，室溫濾紙干或放入膜固定液15分鐘。
2. NcM用PBS沖洗二遍，呈5～6% non－fat milk的pH7.2的PBS中封閉，室溫 ６－８小時(shí)或室溫1－2小時(shí)，4℃，過(guò)夜。
3. 將封閉的膜用ＰＢＳ沖洗一遍，洗15分鐘×1，5分鐘×2。
4. 加入一抗 1:1000－1200，室溫，反應(yīng)1小時(shí)
5. PBS洗15分鐘×1，15分鐘×4。
6. 加入二抗 1:5000，室溫，反應(yīng)1小時(shí)。
7. PBS洗15分鐘×1，5分鐘×4。
六、化學(xué)發(fā)光試劑檢測(cè)
1. 混合等體積Bottle1&2與NcM共孵育1分鐘。
2. 放射自顯影：曝光3分鐘至10分鐘。
3. 顯影后清水漂洗，再定影。
七、所用試劑
1、勻漿緩沖液 4×1L：
|
NaH2PO4（·H2O） |
12.48g |
|
Na2PO4·12H2O |
114.6g |
|
NaCl |
3.6g |
|
dw 800ml, adjust pH to 7.0, adjust Vol to 1 L |
|
（1）用時(shí)稀釋4倍。
（2）40ml PBS＋PMSF 40 ul＋1.10 phenautehroline 80 ul＋Iodo 80ul＋pepstalmA 80ul
2. 系列牛血清蛋白濃度稀釋法：
取500ug / ml BSA按下法配制：
|
|
500ug / ml BSA |
NS |
蛋白濃度ug / ml |
|
S1 |
50 ul |
1.95 ml |
12.5 |
|
S2 |
100 ul |
1.90 ml |
25 |
|
S3 |
200 ul |
1.80 ml |
50 |
|
S4 |
400 ul |
1.60 ml |
100 |
|
S5 |
800 ul |
1.20 ml |
200 |
3. 30瑀ylamide
29.2g單丙、0.8g雙丙溶解于60 mlDDW，調(diào)Vol到100 ml
4. 3M Tris－Hcl buffer pH 8.9 100ml.
稱(chēng)Tris 36.3g溶于水到100 ml，調(diào)pH到8.9
5. 0.5 M Tris－Hcl buffer pH 6.7 100ml
稱(chēng)Tris5.98g溶解后，調(diào)pH到6.7，調(diào)體積到100ml
6. Samples buffer 10ml
|
10%SDS |
2 ml |
|
|
甘油 |
1 ml |
|
|
0.5M Tris |
1.6 ml |
用前按9 : 0.5 : 加0.1溴酚蘭、0.5% DTT貯備液。 |
|
DDW |
5.2 ml |
|
7. 電轉(zhuǎn)液 1L pH 8.2－8.3
|
Glycine |
14.42 g |
|
Tris base |
3.02 g |
|
dH2O |
800 ml |
|
Methanol |
200 ml |
|
10% SDS |
2 ml |
8. pH 7.2 PBS 2 L
|
NaCl |
18.0g |
|
KCl |
0.44g |
|
Na2HPO4 |
2.84g（7.16g） |
|
NaH2PO4 |
0.432g（0.562g） |
|
加DW到2 L |
|
9. 10×電極緩沖液 400 ml pH 8.4
|
Tris base |
12.2 g |
|
甘氨酸 |
57.76 g |
|
加DW 400 ml, 調(diào)pH8.4，用前加SDS0.1% |
|
10. 脫色液1號(hào)
|
甲醇 |
250 ml |
|
冰醋酸 |
50 ml |
|
＋DW到500 ml |
|
11. 脫色液2號(hào)
|
甲醇 |
100 ml |
|
冰醋酸 |
75 ml |
|
＋DW到1000 ml |
|
