1 基因芯片技術(shù)分離目的基因
生物芯片是高密度固定在固相支持介質(zhì)上的生物信息分子的微列陣。列陣中每個分子的序列及位置都是已知的，并按預(yù)先設(shè)定好的順序點陣�；蛐酒巧镄酒囊环N，其上固定的是核算類物質(zhì)，主要用于DNA、RNA分析。分為DNA芯片和微點陣兩種。
分離目的基因是是指從基因組中發(fā)現(xiàn)或找出某個目的（標(biāo)）基因。目前是通過①比較不同物種之間，或同一物種不同個體之間；或同一個體在不同生長發(fā)育是期或不同環(huán)境條件下基因差異表達(dá)（基因表達(dá)平行分析）來實現(xiàn)的。采用基因芯片技術(shù)進(jìn)行基因差異表達(dá)研究可以通過雜交直接檢測到細(xì)胞中mRNA的種類及豐度，與傳統(tǒng)的差異顯示相比具有樣品用量小，自動化程度高，被檢測目標(biāo)DNA密度大及并行種類多等優(yōu)點。②利用同源探針從cDNA或EST微列陣中篩選分離目的基因。目前有DNA芯片、cDNA芯片兩種。其基本步驟包括：基因芯片的制備、靶樣品制備、雜交與檢測、目的基因得分離并獲得全長。
2 基因文庫技術(shù)分離目的基因
基因文庫指某一生物類型全部基因的集合。這種集合是以重組體的形式出現(xiàn)。某生物DNA片段群體與載體分子重組，重組后轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇培養(yǎng)基上生長出的單個菌落（或噬菌斑，或成活細(xì)胞）即為一個DNA片段的克隆。全部DNA片段克隆的集合體即為該生物的基因文庫。其類型很多，如可分為基因組文庫與cDNA文庫、克隆文庫與表達(dá)文庫，按載體分有智力文庫、噬菌體文庫、黏粒載體文庫、人工染色體文庫等�；蛭膸鞓�(gòu)建后，從文庫中篩選基因的方法主要有以下幾種：核算雜交法、免疫學(xué)檢測法、DNA同胞選擇法、PCR篩選法等。基因文庫的構(gòu)建是目前基因工程的核心工作，也是分離目的進(jìn)的常用方法之一。
3 功能蛋白組分離目的基因
蛋白組是指細(xì)胞內(nèi)全部蛋白的存在及活動方式，即基因組表達(dá)產(chǎn)生的總蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱。功能蛋白質(zhì)組指那些可能涉及到特定功能機理的蛋白質(zhì)群體。主要研究方法為蛋白質(zhì)雙向電泳。通過高效液相色譜、質(zhì)普對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，在借用分子生物學(xué)的手段則可以進(jìn)行目的基因的分離。如：應(yīng)用PCR進(jìn)行分離目的基因：通過對蛋白質(zhì)的序列分析，可以通過密碼子的簡并性設(shè)計簡并引物，可利用RT-PCR得到目的基因的全長；應(yīng)用核算雜交篩選法分離目的基因：即利用簡并寡核苷酸探針篩選cDNA或基因組文庫；免疫雪篩選法分離目的基因：是通過蛋白的特異抗體與目的蛋白的專一結(jié)合，從表達(dá)文庫中分離目的基因的蛋白基因。
4 PCR技術(shù)在基因克隆中的應(yīng)用
PCR技術(shù)已經(jīng)滲透到生物學(xué)的各個領(lǐng)域，在分子克隆和獲得cDNA全長方面起著重要的作用。利用PCR技術(shù)對特定條件下基因的表達(dá)進(jìn)行檢測即通過mRNA差別顯示（DDRT-PCR）可鑒定和分離出所需的目的基因；通過RT-PCR克隆到目的基因的cDNA區(qū)域進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建，通過錨定PCR或反向PCR可快速克隆到cDNA末端未知序列、功能基因調(diào)控區(qū)等�，F(xiàn)在可用于基因分離和克隆的PCR方法主要有：RT-PCR，DDRT-PCR，用于cDNA末端快速克隆的RACE（第3小節(jié)），用于DNA序列克隆的Panhankle-PCR、Cassette-PCR以及減法cDNA文庫的PCR法構(gòu)建等。Panhankle-PCR、Cassette-PCR為基因組已知DNA相臨未知序列的克隆奠定了良好的基礎(chǔ)。
5 mRNA差別顯示技術(shù)分離差別表達(dá)基因
mRNA差異顯示技術(shù)是對組織特異性表達(dá)基因進(jìn)行分離的一種快速行之有效的方法之一。它是將mRNA反轉(zhuǎn)錄與PCR技術(shù)結(jié)合發(fā)展起來的一種RNA指紋圖譜技術(shù)。它利用5’錨定引物oligo（dT）12MN和3’端隨機引物對總mRNA進(jìn)行PCR擴增，以期得到差異表達(dá)的條帶。并對其差異顯示的條帶進(jìn)行回收、克隆。
6 插入突變分離克隆目的基因
獲得突變體進(jìn)行未知基因的克隆是常用的方法之一。這里舉T-DNA標(biāo)簽法和轉(zhuǎn)座子誘變分離克隆目的基因的例子。T-DNA標(biāo)簽法是將T-DNA在任何感興趣的基因處產(chǎn)生插入性突變，獲得分析該基因功能的對照突變體。它將T-DNA左右邊界之間攜帶的外源報告基因片段作為一個選擇性的遺傳標(biāo)記，因為插入的序列是已知的，因而對獲得的轉(zhuǎn)基因重組突變體就可以通過各種克隆和PCR策略加以研究。倘若將35S強啟動子在T-DNA整合到宿主基因組后，整合到內(nèi)原基因的上游，則可以產(chǎn)生異常增加或表達(dá)的時空特異性改變而破壞基因的表達(dá)的效果。有獲得性突變和功能喪失性突變等。轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法是將一株攜帶有功能性轉(zhuǎn)座系統(tǒng)的植物與遺傳上有差異的同種植物雜交，因轉(zhuǎn)座因子插入到某一特定的基因序列而破壞了該基因編碼的蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致可見的表性的破壞或改變，這樣就可以在產(chǎn)生后代中篩選出新型的突變體。
7 圖位克隆目的基因
圖位克隆的原理是根據(jù)功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因機密連鎖得分子標(biāo)記篩選DNA文庫，從而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，在利用此物理圖譜通過染色體步移逐步逼近目的基因或通過染色體登錄的方法最終找到包含該目的基因的克隆，并通過遺傳轉(zhuǎn)化實驗證實目的基因的功能。
8 酵母雙雜交系統(tǒng)分離克隆基因
酵母雙雜交系統(tǒng)體系可以發(fā)現(xiàn)蛋白相互作用的蛋白的編碼基因。這種方法的用途有：驗證已知基因間的相互作用；可以快速發(fā)現(xiàn)編碼蛋白與蛋白間相互作用的特定區(qū)域；通過掃描文庫與活化區(qū)域的作用可以發(fā)現(xiàn)相互所用的蛋白，只需一個質(zhì)粒就可以直接得到編碼蛋白的基因，無需制備抗體和純化蛋白。操作相對簡便、快速，不許經(jīng)過蛋白純化即可獲得編碼基因。
9 生物信息學(xué)在分離克隆基因中的應(yīng)用
生物信息學(xué)是在生命科學(xué)的研究中，一計算機為工具對生物信息進(jìn)行儲存、檢索、和分析的科學(xué)�；蚪M信息學(xué)的首要任務(wù)之一就是發(fā)現(xiàn)新的基因核心的功能，時發(fā)現(xiàn)新基因的重要手段。下舉幾例：
利用EST數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)新基因（電腦克�。簩ふ业脚c克隆有關(guān)的EST后，用電子cDNA文庫進(jìn)行篩選；通過生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析和查詢，最終獲得一個基因的全長cDNA。
通過保守區(qū)發(fā)現(xiàn)和可隆基因：即利用同源蛋白質(zhì)的保守序列或同源基因火爆后區(qū)段進(jìn)行電子篩選，在進(jìn)一步拼接、延伸從而獲得全長的cDNA。
從大規(guī)模cDNA文庫測序的序列中確定新基因：首先確定獲得的cDNA是否為基因全長cDNA，確定是否有典型的ORF及3’端及5’端。而后可以通過網(wǎng)上搜索確定是否為新的基因，同源比對在判斷是否為新基因，若通過檢驗則為新的基因。
10 基因分離克隆的新技術(shù)
除上述幾種基本的方法外，隨著生物技術(shù)的發(fā)展和傳統(tǒng)技術(shù)的改良，基因可隆的方法又有許多新的技術(shù)出現(xiàn)。如基因表達(dá)序類標(biāo)記分析（SAGE）；由DDRT-PCR演變而來的代表性差異分析（RDA），包括基因組DNA（gDNA）的RDA和cDNA的RDA；抑制型差減雜交（SSH）——基于反轉(zhuǎn)錄的雙接頭扣除的差異分析；轉(zhuǎn)錄活動的DNA差減雜交技術(shù)（TADSH）、利用限制性片段多態(tài)性的cDNA-AFLP等等。這些技術(shù)作為基因分離可隆的方法，較以前的技術(shù)都具有一定的優(yōu)點，又有各自的不盡相同的用途。
