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液相核酸分子雜交類型

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01

1、吸附雜交
(1)HAP吸附雜交,羥基磷灰石層析或吸附是液相雜交中最早使用的方法,在液相中雜交后,DNA:DNA雜交雙鏈在低鹽條件可特異地吸附到HAP上,通過(guò)離心使吸附有核酸雙鏈HAP沉淀,再用緩沖液離心漂洗幾次HAP,然后將HAP置于計(jì)數(shù)器上進(jìn)行放射性計(jì)數(shù)。

(2)親和吸附雜交:生物素標(biāo)記DNA探針與溶液中過(guò)量的靶RNA雜交,雜交物吸附到;H和素包被的固相支持物(如小球)上,用特異性抗DNA:RNA雜交物的酶標(biāo)單克隆抗體與固相支持物上的雜交物反應(yīng),加入酶顯色底物。這個(gè)系統(tǒng)可快速(2h)檢測(cè)RNA。

(3)磁珠吸附雜交:Gen-Probe公司最近應(yīng)用丫啶翁酯(Acridinium
ester)標(biāo)記DNA探針、這種試劑可用更敏感的化學(xué)方法來(lái)檢測(cè),探針和靶雜交后,雜交物可特異地吸附在磁化的有孔小珠(陽(yáng)離子磁化微球體)上,溶液中的磁性小珠可用磁鐵吸出,經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的漂洗步驟,吸附探針的小珠可用化學(xué)發(fā)光測(cè)定。

2、發(fā)光液相雜交
(1)能量的傳遞法。Heller等設(shè)計(jì)用兩個(gè)緊接的探針,一個(gè)探針的一端用化學(xué)發(fā)光基團(tuán)(供體)標(biāo)記,另一個(gè)探針的一端用熒光物質(zhì)標(biāo)記,并且這兩個(gè)探針靠得很近,兩個(gè)靠得很近的探針用不同的物質(zhì)標(biāo)記(光發(fā)射標(biāo)記)。當(dāng)探針與特異的靶雜交后,這些標(biāo)記物靠得很近,一種標(biāo)記物發(fā)射的光被另一種標(biāo)記物吸收,并重新發(fā)出不同波長(zhǎng)的光,調(diào)節(jié)檢測(cè)器使自動(dòng)記錄第二次發(fā)射光的波長(zhǎng),只有在兩個(gè)探針?lè)肿涌康煤芙鼤r(shí),才能產(chǎn)生激發(fā)光,因此這種方法具有較好的特異性。

(2)丫啶翁酯標(biāo)記法。丫啶翁酯標(biāo)記探針與靶核酸雜交后,未雜交的標(biāo)記探針?lè)肿由系难距の条タ梢杂脤iT(mén)的方法選擇性除去,所以雜交探針的化學(xué)發(fā)光是與靶核酸的量成比例的。該法的缺點(diǎn)是檢測(cè)的敏感度低(1ng的靶核酸),僅適用于檢測(cè)擴(kuò)增的靶序列,如rRNA或PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、液相夾心雜交
(1)親和雜交
在靶核酸存在下,兩個(gè)探針與靶雜交,形成夾心結(jié)構(gòu)。雜交完成后,雜交物可移到新的管或凹孔中,在其中雜交物上的吸附探針可結(jié)合到固相支持物上,而雜交物上的檢測(cè)探針可產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)。用生物素標(biāo)記吸附探針,及125I標(biāo)記檢測(cè)探針。這個(gè)系統(tǒng)的敏感性可檢測(cè)出4×105靶分子,該試驗(yàn)保持了固相夾心雜交的高度特異性。

(2)采用多組合探針和化學(xué)發(fā)光檢測(cè)
第一類探針是未標(biāo)記的檢測(cè)探針和液相吸附探針,它們有50個(gè)堿基長(zhǎng),其中含有30個(gè)細(xì)菌特異序列堿基和20個(gè)堿基的單鏈長(zhǎng)尾;第二類探針是固相吸附探針,它可吸附在小珠或微孔板上。未標(biāo)記檢測(cè)探針的單鏈長(zhǎng)尾用于結(jié)合擴(kuò)增多體(標(biāo)記探針),液相吸附探針和靶雜交物從溶液中分離并固定在小珠或微板上。典型的試驗(yàn)可有25個(gè)不同的檢測(cè)探針和10個(gè)不同的吸附探針,第一個(gè)標(biāo)記檢測(cè)探針上附著很多酶(堿性磷酸酶或過(guò)氧化物酶),可實(shí)現(xiàn)未標(biāo)記檢測(cè)探針的擴(kuò)增,使用化學(xué)發(fā)光酶的底物比用顯色反應(yīng)酶的底物敏感。這個(gè)雜交方法用于乙肝病毒、沙眼衣原體、淋球菌以及質(zhì)?剐缘臋z測(cè),敏感性能達(dá)到檢測(cè)5×104雙鏈DNA分子。

4、復(fù)性速率液相分子雜交
這個(gè)方法的原理是細(xì)菌等原生物的基因組DNA通常不包含重復(fù)順序,它們?cè)谝合嘀袕?fù)性(雜交)時(shí),同源DNA比異源DNA的復(fù)性速度要快,同源程度越多,復(fù)性速率和雜交率越快。利用這個(gè)特點(diǎn),可以通過(guò)分光光度計(jì)直接測(cè)量變性DNA在一定條件下的復(fù)性速率,進(jìn)而用理論推導(dǎo)的數(shù)學(xué)公式來(lái)計(jì)算DNA-DNA之間的雜交(結(jié)合)度。

 

 

 
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