（一）細菌培養(yǎng)物的生長

　　從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長)，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此�，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標準LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時，不必造反性地擴增質(zhì)粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時，以便對質(zhì)粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR３２２－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以完全抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素μg/ml)已成為標準的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。

（二）細菌的收獲和裂解

　　細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取地３個因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出精確的裂解條件不切實際，但仍可據(jù)下述一般準則來選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。1)大質(zhì)粒(大于15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法最大限度地減小了從具有正壓的細菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。2)可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。
　　3)一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時，不宜使用煮沸法。
　　4)當(dāng)從表達內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA 株，如HB101) 中小量制備質(zhì)粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能完全滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟(用酚：氯仿進行抽提)可以避免此問題。
５)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。 大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質(zhì)粒DNA 的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。

(三)質(zhì)粒DNA的純化

　　常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。最后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達到飽和( 每２個堿基對大約結(jié)合１個溴化乙錠分子) （Ｃantor 和Ｓchimmel,1980）。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的首選方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。盡管這些方法大多數(shù)均被束之高閣，但其中最好的方法，也應(yīng)是聚乙二醇分級沉淀法，最近已得到改進（R.Treisman,個人通訊）并達到較高境界， 使用該方法可得到極高純度的質(zhì)粒。聚乙二醇分級沉淀法與氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法有一點不同，那就是不能有效地把帶切口的環(huán)狀分子同閉環(huán)質(zhì)粒DNA分開，因此， 純化容易帶上切口的極大質(zhì)粒（大于15kb）及用于生物物理學(xué)測定的閉環(huán)質(zhì)粒時、平衡離心仍是首選的方法。 然而， 兩種純化方法都可得到足可勝任分子克隆中各種復(fù)雜工作的質(zhì)粒DNA，包括用于哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染以及利用外切核酸酶產(chǎn)生成套的缺失突變體。
　　，對于更常規(guī)的操作，則可全然免卻進一步提純的問題。目前所用的質(zhì)粒大多數(shù)復(fù)制量大，小量制備質(zhì)粒即可得到足量的DNA完成以下種種工作； 限制酶圖的繪制、細菌轉(zhuǎn)化、特定DNA片段的分離、常規(guī)亞克隆及放射性標記探針的制備。