當(dāng)生物芯片和樣品探針雜交完畢后，就需要對(duì)雜交結(jié)果進(jìn)行圖象采集和分析。一般膜芯片的雜交都用同位素p32、p33作標(biāo)記，其信號(hào)的檢測(cè)需通過傳統(tǒng)的磷光成像系統(tǒng)來完成。而對(duì)于用熒光標(biāo)記的玻璃芯片雜交后的檢測(cè)，則需要用專門的熒光芯片掃描儀。

　　1. 磷感屏成像系統(tǒng)Cyclone Storage Phosphor System

　　Cyclone磷屏成像系統(tǒng)為美國(guó)Packard公司生產(chǎn)的第一臺(tái)集高分辨率、高靈敏度和5個(gè)數(shù)量級(jí)的線性范圍于一身的計(jì)算機(jī)控制數(shù)字化自動(dòng)放射成像分析系統(tǒng)，由于其使用方便、快捷、自動(dòng)化程度、分辨率、圖像清晰度均很高，既可定位亦可定量，目前已廣泛應(yīng)用于核醫(yī)藥學(xué)、細(xì)胞與分子生物學(xué)、生物化學(xué)、藥理學(xué)、基因工程學(xué)、藥物代謝動(dòng)力學(xué)、放射免疫及受體免疫等多方面實(shí)驗(yàn)研究，成為十分方便的有力工具。其優(yōu)異品質(zhì)主要得益于Packard專利的激光技術(shù)和共聚焦成像系統(tǒng)。應(yīng)用范圍為我們前面介紹的DNA Macroarray以及Northern、Southern、Western Blot.，手工測(cè)序，放射性原位雜交等的同位素結(jié)果檢測(cè)。使用Cyclon磷屏可以大大縮短研究周期，獲得清晰的分辨率。

　　其工作原理在于：同位素標(biāo)記的雜交結(jié)果在磷屏上曝光，曝光過程32P等核素核衰變同時(shí)發(fā)射β射線，首先激發(fā)磷屏上分子，使磷屏吸收能量分子發(fā)生氧化反應(yīng)，以高能氧化態(tài)形式儲(chǔ)存在磷屏分子中。激光掃描磷屏，對(duì)于激發(fā)態(tài)高能氧化態(tài)磷屏分子發(fā)生還原反應(yīng)，即從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)多余的能量以光子形式釋放，從而在PMT捕獲進(jìn)行光電轉(zhuǎn)換，磷屏分子回到還原態(tài)。計(jì)算機(jī)接受電信號(hào)，經(jīng)處理形成屏幕圖像，并進(jìn)一步分析和定量。一般化學(xué)發(fā)光物質(zhì)如熒光染料標(biāo)記樣品成像過程與放射性類似。

　　系統(tǒng)特點(diǎn)

　　放射性自顯影成像系統(tǒng)。儲(chǔ)存式磷屏根據(jù)不同樣品厚度、射線能量有多種型號(hào)磷屏可供選擇，磷屏可以多次重復(fù)使用。

　　靈敏度較X光片高數(shù)十倍，可以檢測(cè)最弱的信號(hào)。曝光時(shí)間可以縮短20倍以上。

　　快速成像，從對(duì)磷屏進(jìn)行掃描到獲得完整的的數(shù)字化圖像，總共需要不到10min的時(shí)間，實(shí)時(shí)圖像顯示，同時(shí)立即報(bào)告分析結(jié)果。

　　可對(duì)放射性位置和強(qiáng)度進(jìn)行相關(guān)的定位、定量分析，寬達(dá)105的線性范圍，定量準(zhǔn)確。

　　不需膠片、暗室設(shè)備、沖洗底片，一步到位完成分析過程。

　　可選配Ouant ArrayTM 軟件，用于尼龍膜上同位素標(biāo)計(jì)的Gene Array定量分析。

　　2. 熒光芯片掃描儀

　　由于雜交時(shí)產(chǎn)生序列重疊，會(huì)有成百上千的雜交點(diǎn)出現(xiàn)在圖譜上，形成極為復(fù)雜的雜交圖譜。序列重疊雖然可為每個(gè)堿基的正確讀出提供足夠的信息，可提高序列分析的可靠性，但同時(shí)信息處理量也大大增加了。一般說來，這些圖譜的多態(tài)性處理與存儲(chǔ)都由專門設(shè)計(jì)的軟件來完成，而不是通過對(duì)比進(jìn)行人工讀譜。用計(jì)算機(jī)處理即可給出目的基因的結(jié)構(gòu)或表達(dá)信息。掃描一張10cm2的芯片大概需要2-6分種的時(shí)間。目前專用于熒光掃描的掃描儀根據(jù)原理不同大致分為兩類：一是激光共聚焦顯微鏡的原理, 是基于PMT（photomultiplier tube，光電倍增管）的檢測(cè)系統(tǒng)（另文介紹）；另一種是CCD（charge-coupled devices，電荷偶合裝置）攝像原理檢測(cè)光子。CCD一次可成像很大面積的區(qū)域，而以PMT為基礎(chǔ)的熒光掃描儀則是以單束固定波長(zhǎng)的激光來掃描，因此或者需要激光頭，或者需要目的芯片的機(jī)械運(yùn)動(dòng)來使激光掃到整個(gè)面積，這樣就需要耗費(fèi)較多的時(shí)間來掃描；但是CCD有其缺點(diǎn)：目前性能最優(yōu)越的CCD數(shù)字相機(jī)的成像面積只有16×12mm（像素為10μm），因此要達(dá)到整個(gè)芯片的面積20×60mm的話，需要數(shù)個(gè)數(shù)碼相機(jī)同時(shí)工作，或者也可以以降低分辨率為代價(jià)來獲得掃描精度不是很高的圖像。由于靈敏度和分辯率較低，比較適合臨床診斷用。

　　生產(chǎn)商業(yè)化掃描儀的公司包括：Genomic Solutions公司、Packard公司、GSI公司、Molecular Dynamics、Genetic Microsystems公司、Axon Instruments公司等。其中GSI Lumonics 公司ScanArray 系列一直是生物芯片掃描檢測(cè)系統(tǒng)中的領(lǐng)頭產(chǎn)品。2000GSI并入著名的Parkard公司后ScanArray的軟、硬件都得到進(jìn)一步加強(qiáng)。

　　ScanArray利用其專利的激光共聚焦光學(xué)系統(tǒng)，通過計(jì)算機(jī)控制，對(duì)生物芯片的熒光雜交信號(hào)進(jìn)行全自動(dòng)的掃描采集，并通過分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

　　最高靈敏度高：<0.1熒光分子/μm

　　掃描精度可從5μm-50μm分級(jí)調(diào)整

　　全范圍掃描時(shí)間僅需5分鐘，快速方便

　　多達(dá)十種檢測(cè)濾光片，涵蓋所有生物芯片熒光染料的檢測(cè)，適用于多種熒光標(biāo)記探針

　　不同波長(zhǎng)依次掃描避免交叉光污染

　　掃描后的圖像還需要進(jìn)一步的處理，這要求一定的軟件支持�，F(xiàn)有的分析軟件包括：Biodiscovery的ImaGene系列，Axon Instruments的GenePix系列，GSI的QuantArray等

　　3. 基因芯片上各克隆熒光信號(hào)的分析原理

　　用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強(qiáng)；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5），不雜交的無熒光。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析，得用激光激發(fā)芯片上的樣品發(fā)射熒光，嚴(yán)格配對(duì)的雜交分子，其熱力學(xué)穩(wěn)定性較高，熒光強(qiáng)；不完全雜交的雙鍵分子熱力學(xué)穩(wěn)定性低，熒光信號(hào)弱（不到前者的1/35~1/5）（2），不雜交的無熒光。不同位點(diǎn)信號(hào)被激光共焦顯微鏡，或落射熒光顯微鏡等檢測(cè)到，由計(jì)算機(jī)軟件處理分析，得到到有關(guān)基因圖譜。美國(guó)GSI Lumonics 公司開發(fā)出專專業(yè)基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)(ScanArray 系列),采用激光共聚焦掃描原理進(jìn)行熒光信號(hào)采集，由計(jì)算機(jī)處理熒光信號(hào)，并對(duì)每個(gè)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度數(shù)字化后進(jìn)行分析。利用QuantArray軟件包對(duì)掃描的熒光信號(hào)進(jìn)行分析，比

　　較每個(gè)克隆在不同組織間表達(dá)水平的差別。軟件具體分析步驟如下：

　　首先，同時(shí)導(dǎo)入同一區(qū)域兩個(gè)channel掃描的圖像文件；將兩個(gè)channel掃描的圖像用不同的顏色顯示并重疊；選擇擬分析的區(qū)域，輸入矩陣的行數(shù)及列數(shù)以及矩陣的個(gè)數(shù)等參數(shù)；在計(jì)算機(jī)給出的該區(qū)域信號(hào)圖片上標(biāo)定網(wǎng)格，使得網(wǎng)格中所包含的橫線和豎線的交點(diǎn)個(gè)數(shù)同每個(gè)區(qū)域點(diǎn)樣的克隆數(shù)相同，調(diào)整網(wǎng)格，使每個(gè)交點(diǎn)均位于點(diǎn)樣克隆信號(hào)的中心；信號(hào)的中心確定后，計(jì)算機(jī)將自動(dòng)以交點(diǎn)為中心，按照設(shè)定的半徑圈定各克隆，并將其內(nèi)部區(qū)域作為待分析的信號(hào)，同時(shí)在圈定的各克隆周圍再按照預(yù)設(shè)的值圈定一定范圍的區(qū)域，將該區(qū)域內(nèi)的信號(hào)作為背景噪音；計(jì)算機(jī)分析每個(gè)克隆扣除背景噪音后的信號(hào)強(qiáng)度，并按照不同的要求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析；利用GenePie方式對(duì)兩個(gè)channel信號(hào)的進(jìn)行定量比較分析，此時(shí)計(jì)算機(jī)根據(jù)各克隆兩個(gè)channel掃描的信號(hào)，以餅圖的形式給出兩個(gè)channel信號(hào)強(qiáng)度的相對(duì)比例，同時(shí)可以逐個(gè)克隆讀取計(jì)算機(jī)分析出的兩個(gè)channel信號(hào)的值及所占的比例，進(jìn)而確定各克隆在兩種組織間的表達(dá)差異。

　　4. Microarray數(shù)據(jù)分析

　　Microarray數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)單來說就是對(duì)Microarray高密度雜交點(diǎn)陣圖象處理并從中提取雜交點(diǎn)的熒光強(qiáng)度信號(hào)進(jìn)行定量分析，通過有效數(shù)據(jù)的篩選和相關(guān)基因表達(dá)譜的聚類，最終整合雜交點(diǎn)的生物學(xué)信息，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)譜與功能可能存在的聯(lián)系。

　　Microarray數(shù)據(jù)分析主要包括圖象分析(Biodiscovery Imagene 4.0\Quantarray分析軟件)、標(biāo)準(zhǔn)化處理（normalization）、Ratio值分析、基因聚類分析（Gene Clustering）。

　　1. 圖象分析：激光掃描儀Scaner得到的Cy3/Cy5圖象文件通過劃格（Griding），確定雜交點(diǎn)范圍，過濾背景噪音，提取得到基因表達(dá)的熒光信號(hào)強(qiáng)度值，最后以列表形式輸出。

　　2. 標(biāo)準(zhǔn)化處理（Normalization）：由于樣本差異、熒光標(biāo)記效率和檢出率的不平衡，需對(duì)cy3和cy5的原始提取信號(hào)進(jìn)行均衡和修正才能進(jìn)一步分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，Normalization正是基于此種目的。Normalization的方法有多種：一組內(nèi)參照基因（如一組看家基因）校正Microarray所有的基因、陽性基因、陰性基因、單個(gè)基因。

　　3. Ratio分析(Ratio Analysis)：cy3/cy5的比值，又稱R/G值。一般0.5-2.0范圍內(nèi)的基因不存在顯著表達(dá)差異，該范圍之外則認(rèn)為基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著改變。由于實(shí)驗(yàn)條件的不同，此域值范圍會(huì)根據(jù)可信區(qū)間有所調(diào)整。處理后得到的信息再根據(jù)不同要求以各種形式輸出，如柱形圖、餅形圖、點(diǎn)圖、原始圖象拼圖等。將每個(gè)Spot的所有相關(guān)信息如位標(biāo)、基因名稱、克隆號(hào)、PCR結(jié)果、信號(hào)強(qiáng)度、Ratio值等自動(dòng)關(guān)聯(lián)并根據(jù)需要篩選數(shù)據(jù)。每個(gè)Spot的原始圖象另存文件，可根據(jù)需要任意排序，得到原始圖象的拼圖，對(duì)于結(jié)果分析十分有利。

　　4. 聚類分析(Clustering Analysis)：實(shí)際是一種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。通過建立各種不同的數(shù)學(xué)模型，可以得到各種統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，確定不同基因在表達(dá)上的相關(guān)性，從而找到未知基因的功能信息或已知基因的未知功能。Gene Clustering就是根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析原理，對(duì)具有相同統(tǒng)計(jì)行為的多個(gè)基因進(jìn)行歸類的分析方法，歸為一個(gè)簇的基因在功能上可能相似或關(guān)聯(lián)。目前以直觀圖形顯示GeneCluster結(jié)果的程序已有人開發(fā)出來，可將抽象的數(shù)據(jù)結(jié)果轉(zhuǎn)化成直觀的樹形圖，便于研究人員理解和分析。

　　盡管基因芯片技術(shù)受到了廣泛關(guān)注，但在基因表達(dá)譜分析中起著關(guān)鍵作用的生物信息學(xué)卻沒能引起大家的足夠重視，認(rèn)為簡(jiǎn)單人工處理一下原始數(shù)據(jù)就可以得到有價(jià)值的生物學(xué)信息，大量有價(jià)值的信息就這樣被浪費(fèi)和湮沒了。可以肯定地說，沒有生物信息學(xué)的有效參與，基因芯片技術(shù)就不能發(fā)揮最大效能。加大基因芯片技術(shù)中生物信息學(xué)的研究開發(fā)力度已成為當(dāng)務(wù)之急。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)進(jìn)行了有益的嘗試，初步開發(fā)出供芯片平臺(tái)管理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的軟件包，就目前實(shí)際情況來看，生物信息學(xué)在基因芯片研究開發(fā)中介入的程度已經(jīng)越來越深，主要涉及基因表達(dá)信息分析管理系統(tǒng)及其分析工具和分析方法，簡(jiǎn)單概括為以下幾個(gè)方面：

　　基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)

　　基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)是整個(gè)基因表達(dá)信息分析管理系統(tǒng)的核心。Microarray數(shù)據(jù)庫(kù)起著數(shù)據(jù)儲(chǔ)存和查詢、各種相關(guān)信息的整合的作用。Microarray數(shù)據(jù)庫(kù)可以包含用戶的管理信息、原始實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖象文件、信號(hào)強(qiáng)度值、背景平均值行列號(hào)、基因號(hào)等）、各種實(shí)驗(yàn)參數(shù)（Plates/unigene/Sets/Clusters）、探針相關(guān)信息、 clone相關(guān)信息（基因名稱、基因序列、GenBank accession號(hào)、克隆標(biāo)志符（IMAGE和內(nèi)部）、代謝途徑標(biāo)志符、內(nèi)部克隆標(biāo)志符）、分析處理結(jié)果、芯片設(shè)計(jì)相關(guān)的資源和數(shù)據(jù)，等等。

　　分析方法：

　　選擇分析方法的基本標(biāo)準(zhǔn)：能夠簡(jiǎn)化原始數(shù)據(jù)，結(jié)果直觀，使研究者能在海量基因表達(dá)數(shù)據(jù)中解析出正確的基因表達(dá)譜和功能信息。一個(gè)理想的分析方法是建立在合理的算法基礎(chǔ)之上的，應(yīng)該能全面綜合并直觀地解析原始數(shù)據(jù)，修正已有數(shù)據(jù)，并從結(jié)構(gòu)、序列、功能之間找到新聯(lián)系。目前已有報(bào)道用于microarray數(shù)據(jù)分析的方法主要有以下幾種：

　　手工分類法（Manual classification Method）

　　該方法在Botstein 實(shí)驗(yàn)室的Michael Eisen提出新的分析方法之前是唯一用來分析microarray數(shù)據(jù)的方法。其基本原理是通過對(duì)microarray的ratio值從大到小排序，篩出表達(dá)顯著性改變的基因。結(jié)果可直觀地從二維plot圖得到。優(yōu)點(diǎn)是能夠有效篩選潛在的腫瘤標(biāo)記基因和藥物靶位點(diǎn)；可以構(gòu)建多組基因誘導(dǎo)或抑制的時(shí)間表達(dá)譜。缺點(diǎn)是結(jié)論過于簡(jiǎn)單；很難發(fā)現(xiàn)更高層次功能線索；處理耗時(shí)且不能充分利用數(shù)據(jù)，也不能發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)錯(cuò)誤。

　　非監(jiān)督聚類法(Unsupervised Clustering)又稱配對(duì)平均連鎖聚類分析(Pairwise average-linkage cluster analysis)。該方法是分層聚類的一種形式，非常類似系統(tǒng)發(fā)生分析。該方法是基于標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)的計(jì)算。K -mean方法是unsupervised聚類法的一個(gè)變化，目前Stanford University 的Botstein實(shí)驗(yàn)室和NHGRI的Trent實(shí)驗(yàn)室都采用該分析方法。

　　混合聚類法(Hybrid clustering approach)該聚類方法通過將每一數(shù)據(jù)點(diǎn)傅立葉變換尋找那些表達(dá)呈周期性變化的基因，比如細(xì)胞周期涉及的基因。所謂混合聚類就是先unsupervised聚類再supervised聚類。優(yōu)點(diǎn)是可以整合以前手工聚類法得到的數(shù)據(jù)；尤其適合確認(rèn)細(xì)胞周期調(diào)控的特征性表達(dá)譜。

　　神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方法(Neural network approach)運(yùn)用自組織圖（Self organizing maps）并結(jié)合supervised法進(jìn)行聚類。優(yōu)點(diǎn)是分類標(biāo)準(zhǔn)明確；優(yōu)化的次序好于其它聚類法；用一種次序風(fēng)格處理大量數(shù)據(jù)易于被生物學(xué)家接受。