色譜法,又稱層析法。根據(jù)其分離原理,有吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜等方法。
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?? 吸附色譜是利用吸附劑對(duì)被分離物質(zhì)的吸附能力不同,用溶劑或氣體洗脫,以使組分分離。常用的吸附劑有氧化鋁、硅膠、聚酰胺等有吸附活性的物質(zhì)。
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?? 分配色譜是利用溶液中被分離物質(zhì)在兩相中分配系數(shù)不同,以使組分分離。其中一相為液體,涂布或使之鍵合在固體載體上,稱固定相;另一相為液體或氣體,稱流動(dòng)相。常用的載體有硅膠、硅藻土、硅鎂型吸附劑與纖維素粉等。
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?? 離子交換色譜是利用被分離物質(zhì)在離子交換樹脂上的離子交換勢(shì)不同而使組分分離。常用的有不同強(qiáng)度的陽、陰離子交換樹脂,流動(dòng)相一般為水或含有有機(jī)溶劑的緩沖液。
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?? 排阻色譜又稱凝膠色譜或凝膠滲透色譜,是利用被分離物質(zhì)分子量大小的不同和在填料上滲透程度的不同,以使組分分離。常用的填料有分子篩、葡聚糖凝膠、微孔聚合物、微孔硅膠或玻璃珠等,可根據(jù)載體和試樣的性質(zhì),選用水或有機(jī)溶劑為流動(dòng)相。
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?? 色譜法的分離方法,有柱色譜法、紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。色譜所用溶劑應(yīng)與試樣不起化學(xué)反應(yīng),并應(yīng)用純度較高的溶劑。色譜時(shí)的溫度,除氣相色譜法或另有規(guī)定外,系指在室溫下操作。
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?? 分離后各成分的檢出,應(yīng)采用各單體中規(guī)定的方法。通常用柱色譜、紙色譜或薄層色譜分離有色物質(zhì)時(shí),可根據(jù)其色帶進(jìn)行區(qū)分,對(duì)有些無色物質(zhì),可在245-365nm的紫外燈下檢視。紙色譜或薄層色譜也可噴顯色劑使之顯色。薄層色譜還可用加有熒光物質(zhì)的薄層硅膠,采用熒光熄滅法檢視。用紙色譜進(jìn)行定量測(cè)定時(shí),可將色譜斑點(diǎn)部分剪下或挖取,用溶劑溶出該成分,再用分光光度法或比色法測(cè)定,也可用色譜掃描儀直接在紙或薄層板上測(cè)出,也可用色譜掃描儀直接以紙或薄層板上測(cè)出。柱色譜、氣相色譜和高效液相色譜可用接于色譜柱出口處的各種檢測(cè)器檢測(cè)。柱色譜還可分部收集流出液后用適宜方法測(cè)定。 柱色譜法
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?? 所用色譜管為內(nèi)徑均勻、下端縮口的硬質(zhì)玻璃管,下端用棉花或玻璃纖維塞住,管內(nèi)裝有吸附劑。色譜柱的大小,吸附劑的品種和用量,以及洗脫時(shí)的流速,均按各單體中的規(guī)定。吸附劑的顆粒應(yīng)盡可能保持大小均勻,以保證良好的分離效果,除另有規(guī)定外通常多采用直徑為0.07-0.15mm的顆粒。吸附劑的活性或吸附力對(duì)分離效果有影響,應(yīng)予注意。
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?? 吸附劑的填裝 干法:將吸附劑一次加入色譜管,振動(dòng)管壁使其均勻下沉,然后沿管壁緩緩加入開始層析時(shí)使用的流動(dòng)相,或?qū)⑸V管下端出口加活塞,加入適量的流動(dòng)相,旋開活使流動(dòng)相緩緩滴出,然后自管頂緩緩加入吸附劑,使其均勻地潤濕下沉,在管內(nèi)形成松緊適度的吸附層。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。濕法:將吸附劑與流動(dòng)相混合,攪拌以除去空氣泡,徐徐傾入色譜管中,然后再加入流動(dòng)相,將附著于管壁的吸附劑洗下,使色譜柱表面平整。 俟填裝吸附劑所用流動(dòng)相從色譜柱自然流下,液面將柱表面相平時(shí),即加試樣溶液。
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?? 試樣的加入 除另有規(guī)定外,將試樣溶于層析時(shí)使用的流動(dòng)相中,再沿色譜管壁緩緩加入。注意勿使吸附劑翻起;?qū)⒃嚇尤苡谶m當(dāng)?shù)娜軇┲。與少量吸附劑混勻,再使溶劑揮發(fā)去盡后使呈松散狀;將混有試樣的吸附劑加在已制備好的色譜柱上面。如試樣在常用溶劑中不溶解,可將試樣與適量的吸附劑在乳缽中研磨混勻后加入。
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?? 洗脫 除另有規(guī)定外,通常按流動(dòng)相洗脫能力大小,遞增變換流動(dòng)相的品種和比例,分別分部收集流出液,至流出液中所含成分顯著減少或不再含有時(shí),再改變流動(dòng)相的品種和比例。操作過程中應(yīng)保持有充分的流動(dòng)相留在吸附層的上面。
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?? 紙色譜法
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?? 以紙為載體,用單一溶劑或混合溶劑進(jìn)行分配。亦即以紙上所含水分或其他物質(zhì)為固定相,用流動(dòng)相進(jìn)行展開的分配色譜法。
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?? 所用濾紙應(yīng)質(zhì)地均勻平整,具有一定機(jī)械強(qiáng)度,必須不含會(huì)影響色譜效果的雜質(zhì),也不應(yīng)與所用顯色劑起作用,以免影響分離和鑒別效果,必要時(shí)可作特殊處理后再用。 試樣經(jīng)層析后可用比移值(Rf)表示各組成成分的位置(比移值=原點(diǎn)中心至色譜斑點(diǎn)中心的距離與原點(diǎn)中心至流動(dòng)相前沿的距離之比),由于影響比移值的因素較多,因此一般采用在相同實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)照物質(zhì)對(duì)比以確定其異同。作為單體鑒別時(shí),試樣所顯主色譜斑點(diǎn)的顏色(或熒光)與供置,應(yīng)與對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn))樣所顯主色的譜斑點(diǎn)或供試品-對(duì)照品(1∶1)混合所顯的主色譜斑點(diǎn)相同。作為質(zhì)量指標(biāo)(純度)檢查時(shí),可取一定量的試樣,經(jīng)展開后,按各單體的規(guī)定,檢視其所顯雜質(zhì)色譜斑點(diǎn)的個(gè)數(shù)或呈色(或熒光)的強(qiáng)度。作為含量測(cè)定時(shí),可將色譜斑點(diǎn)剪下洗脫后,再用適宜的方法測(cè)定,也可用色譜掃描儀測(cè)定。
1、下行法 所用色譜缸一般為圓形或長方形玻璃缸,缸上有磨口玻璃蓋,應(yīng)能密閉,蓋上有孔,可插入分液漏斗,以加入流動(dòng)相。在近缸頂端有一用支架架起的玻璃槽作為流動(dòng)相的容器,槽內(nèi)有一玻璃棒,用以支持色譜濾紙使其自然下垂,避免流動(dòng)相沿濾紙與溶劑槽之間發(fā)生虹吸現(xiàn)象。
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?? 取適當(dāng)?shù)纳V濾紙按纖維長絲方向切成適當(dāng)大小的紙條,離紙條上端適當(dāng)?shù)木嚯x(使色譜紙上端能足夠浸入溶劑槽內(nèi)的流動(dòng)相中,并使點(diǎn)樣基線能在溶劑槽側(cè)的玻璃支持棒下數(shù)厘米處)用鉛筆劃一點(diǎn)樣基線,必要時(shí)色譜紙下端可切成鋸齒形,以便于流動(dòng)相滴下。 將試樣溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲校瞥梢欢舛鹊娜軇。用微量吸管或微量注射器吸取溶劑,點(diǎn)于點(diǎn)樣基線上,溶液宜分次點(diǎn)加,每次點(diǎn)加后,俟其自然干燥、低溫烘干或經(jīng)溫?zé)釟饬鞔蹈。樣點(diǎn)直徑一般不超過0.5cm,樣點(diǎn)通常應(yīng)為圓形。
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?? 將點(diǎn)樣后的色譜濾紙上端放在溶劑槽內(nèi),并用玻璃棒壓住,使色譜紙通過槽側(cè)玻璃支持棒自然下垂,點(diǎn)樣基線在支持棒下數(shù)厘米處。色譜開始前,色譜缸內(nèi)用各單體中所規(guī)定的溶劑的蒸氣飽和,一般可在色譜缸底部放一裝有流動(dòng)相的平皿,或?qū)⒔辛鲃?dòng)相的濾紙條附著在色譜缸的內(nèi)壁上,放置一定時(shí)間,俟溶劑揮發(fā)使缸內(nèi)充滿飽和蒸氣。然后添加流動(dòng)相,使浸沒溶劑槽內(nèi)濾紙,流動(dòng)相即經(jīng)毛細(xì)管作用沿濾紙移動(dòng)進(jìn)行展開至規(guī)定距離后,取出濾紙,標(biāo)明流動(dòng)相前沿位置,俟流動(dòng)相揮散后按規(guī)定方法檢出色譜斑點(diǎn)。
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?? 2、上行法 色譜缸基本和下行法相似,唯除去溶劑槽和支架,并在色譜缸蓋上的孔中加塞,塞中插入玻璃懸鉤,以便將點(diǎn)樣后的色譜濾紙掛在鉤上。色譜濾紙一般長約25cm,寬度則視需要而定。必要時(shí)可將色譜濾紙卷成筒形。點(diǎn)樣基線距底邊約2.5cm,點(diǎn)樣方法與下行法相同。色譜缸內(nèi)加入適量流動(dòng)相,放置,俟流動(dòng)相蒸氣飽和后,再下降懸鉤,使色譜濾紙浸入流動(dòng)相約0.5cm,流動(dòng)相即經(jīng)毛細(xì)管作用沿色譜濾紙上升,除另有規(guī)定外,一般展開至15cm后,取出晾干,按規(guī)定方法檢視。
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?? 色譜可以向一個(gè)方向進(jìn)行,即單向色譜;也可進(jìn)行雙向色譜,即先向一個(gè)方向展開,取出,俟流動(dòng)相完全揮發(fā)后,將濾紙轉(zhuǎn)90°,再用原流動(dòng)相或另一種流動(dòng)相進(jìn)行展。亦可多次展開,連續(xù)展或徑向色譜等。
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?? 薄層色譜法
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?? 按各單體所規(guī)定的載體,放入適當(dāng)容器,加入適量水以配成懸浮液,在厚度均勻一致的50×200mm或200×200mm平滑玻璃板上將此懸浮液均布成0.25mm的厚度,風(fēng)干后一般在110度下干燥0.5-1h(或按單體規(guī)定)。
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?? 以離薄層板一端約25mm的位置作為點(diǎn)樣基線,用微量吸管按規(guī)定量吸取試樣液和對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn))液,點(diǎn)于基線上,點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離在10mm以上,液點(diǎn)的直徑約3mm,風(fēng)干后,基線一端向下,將薄層板放入展開溶劑,溶劑層深10mm,并預(yù)經(jīng)開展溶劑的蒸汽飽和。在展開溶劑從基線上升至規(guī)定距離(一般為15cm)后,取出薄層板,風(fēng)干,然后按規(guī)定的方法,對(duì)斑點(diǎn)的位置和顏色進(jìn)行檢查。
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?? 氣相色譜法
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?? 氣相色譜法是在以適當(dāng)?shù)墓潭ㄏ嘧龀傻闹軆?nèi),利用氣體(載氣)作為移動(dòng)相,使試樣(氣體、液體或固體)在氣體狀態(tài)下展開,在色譜柱內(nèi)分離后,各種成分先后進(jìn)入檢測(cè)器,用記錄儀記錄色譜譜圖。 在對(duì)裝置進(jìn)行調(diào)試后,按各單體的規(guī)定條件調(diào)整柱管、檢測(cè)器、溫度和載氣流量。進(jìn)樣口溫度一般應(yīng)高于柱溫30-50度。如用火焰電離檢測(cè)器,其溫度應(yīng)等于或高于柱溫,但不得低于100度,以免水汽凝結(jié)。色譜上分析成分的峰的位置,以滯留時(shí)間(從注入試樣液到出現(xiàn)成分最高峰的時(shí)間)和滯留容量(滯留時(shí)間×載氣流量)來表示。這些在一定條件下,就能反應(yīng)出物質(zhì)所具有特殊值,并據(jù)此確定試樣成分。
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?? 根據(jù)色譜上出現(xiàn)的物質(zhì)成分的峰面積或峰高進(jìn)行定量。峰面積可用面積測(cè)定儀測(cè)定,按半寬度法求得(即以峰1/2處的峰寬×峰高求得)。峰高的測(cè)定方法是從峰高的頂點(diǎn)向記錄紙橫座標(biāo)準(zhǔn)垂線,找出此垂線與峰的兩下端聯(lián)結(jié)線的交點(diǎn),即以此交點(diǎn)至峰頂點(diǎn)的距離長度為峰高。
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?? 定量方法可分以下三種:
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?? 1、內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)法 取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分,按依次增加或減少的已知階段量,各自分別加入各單體所規(guī)定的定量內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中,調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取此標(biāo)準(zhǔn)液的一定量注入色譜柱,根據(jù)色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積和峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積和峰高的比例為縱座標(biāo),取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量之比,或標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分量為橫坐標(biāo),制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。
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?? 然后按單體中所規(guī)定的方法調(diào)制試樣液。在調(diào)制試樣液時(shí),預(yù)先加入與調(diào)制標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)等量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。然后按制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的同樣條件下得出的色譜,求出被測(cè)成分的峰面積或峰高和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰積或峰高之比,再按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)成分的含量。
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?? 所用的內(nèi)標(biāo)物質(zhì),應(yīng)采用其峰面積的位置與被測(cè)成分的峰的位置盡可能接近并與被測(cè)成分以外的峰位置完全分離的穩(wěn)定的物質(zhì)。
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?? 2、絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法 取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分 按依次增加或減少階段法,各自調(diào)制成標(biāo)準(zhǔn)液,注入一定量后,按色譜圖取標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的峰面積或峰高為縱座標(biāo),而以標(biāo)準(zhǔn)被測(cè)成分的含量為橫坐標(biāo),制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后按單體中所規(guī)定的方法制備試樣液。取試樣液按制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)相同的條件作出色譜,求出被測(cè)成分的峰面積和峰高,再按標(biāo)準(zhǔn)曲線求出被測(cè)成分的含量。 3、峰面積百分率法 以色譜中所得各種成分的峰面積的總和為100,按各成分的峰面積總和之比,求出各成分的組成比率。
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?? 氣液色譜法
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?? 這時(shí)所指的氣液色譜法,主要用于各種香料物質(zhì)的分析,基本條件和參數(shù)主要依照美國精油協(xié)會(huì)(EOA)于1979年所建議的方法。其基本原理、操作、標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài)等均與上述氣相色譜法相同。
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?? 1、柱 用304號(hào)合金所制不銹鋼管,長3m,內(nèi)徑2.16-2.57mm,外徑3.18mm。底物:極性柱為聚乙二醇20M(Carbowax 20M),分子量約2萬;非極性柱為氣相色譜級(jí)甲基硅氧烷(SE-30),或二甲基硅氧烷(OV-1或OV-101)。底物濃度:重量的105。固體載體:10目或20目熔融煅燒過的硅藻土,經(jīng)硅烷化和酸洗后,其自由傾落密度為0.2g/cm3,最小120目,最大80目。裝填密度每cm3應(yīng)大于0.24g。
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?? 2、載氣 氦。最低流量為每分鐘25-50ml。
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?? 分析狀態(tài)
?? 極性柱:起始溫度,最低75度;最終溫度,最高225度。升溫速度,每分鐘2-8度。
?? 非極性柱:起始溫度,最低75度;最終溫度,不超過275度;升溫速度,每分鐘2-8度。
?? 進(jìn)樣溫度:225-250度。試樣量:0.1-1ul。
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?? 檢測(cè)器:用熱導(dǎo)池。檢測(cè)器的操作條件應(yīng)維持恒定。