限制性核酸內(nèi)切酶:
是一類能識別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具,所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。
瓊脂糖凝膠電泳:
是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性,其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就可以向陽極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率,因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA片段。
EB:即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽, (Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入,在紫外光的照射下,凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光,易于檢測?梢詸z測10ng 的DNA。
質(zhì)粒 pCMV-Myc-T10 NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder) EcoR1 和 Xho1 核酸內(nèi)切酶(Takara) EcoR 1和 Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer) 瓊脂糖 TBE或TAE緩沖液(10×) 溴化乙啶染色液(10mg/ml) 上樣液(6×):0.25% 溴酚蘭,40%(W/V)蔗糖 水溶液或30%的甘油。 電泳儀,電泳槽,紫外透射儀,凝膠成像儀,一次性塑料手套等 .
1) 質(zhì)粒DNA的酶解(自提質(zhì)粒pCMV-Myc-T10)
質(zhì)粒量(ng)
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緩沖液(μl)*
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EcoR1(μl)
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Xho1(μl)
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H2O (μl)
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總體積(μl)
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I
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200
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2
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0
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0
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17-19
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20
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II
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200
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2
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0.5
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0
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15-17
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20
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III
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200
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2
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0.5
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0.5
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14-16
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20
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* 緩沖液隨不同的酶而不同,本實(shí)驗用 H buffer。 置于37℃水浴酶解0.5-1小時。酶解完成后,分別加入10?l 3倍的上樣緩沖液, 然后各取15?l進(jìn)行電泳分析。
2) 瓊脂糖凝膠的制備:
稱取0.8g瓊脂糖,置于三角瓶中,加入100ml TBE或TAE工作液,瓶口倒扣一個小燒杯等,將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。
3)膠板的制備:
取有機(jī)玻璃內(nèi)槽,洗凈、晾干;取紙膠條(寬約1cm),將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上,放好梳子。 將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液,小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上,控制灌膠速度和量,使膠液緩慢地展開,直到在整個有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右,待凝固完全后,輕輕拔出梳子,在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有0.5-1×TAE(Tris-乙酸) 或TBE(Tris-硼酸)工作液的電泳槽中使用。
4)加樣:
用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個樣品,換一個加樣頭。加樣時應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部,本實(shí)驗樣品孔容量約15~20 ul。1 kb DNA ladder(共10條帶): 在第一個上樣孔或最后一個上樣孔內(nèi)加入6ul 的 1 kb DNA ladder(50ng/ul )。
5)電泳(帶上手套操作):
加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳;
建議在80~100V的電壓下電泳;
當(dāng)溴酚蘭移動到距離膠板下沿約1cm處停止電泳;
將凝膠放入溴化乙啶(EB〕工作液(0.5ug/ml左右)中染色約20min。
為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率,電場強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm(兩電極間的距離)。電泳溫度視需要而定,對大分子的分離,以低溫較好,也可在室溫下進(jìn)行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時,由于膠太稀,最好在4℃進(jìn)行電泳以增加凝膠硬度。
6)觀察與拍照:
在紫外燈(310nm波長)下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā)30s左右,肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時,應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩,避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷。拍照電泳圖譜時,可采用快速凝膠成象系統(tǒng)。
對于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來說,常會出現(xiàn)兩條電泳帶,一條是(松弛)螺旋狀質(zhì)粒DNA帶,另一條是超螺旋狀質(zhì)粒DNA的帶,以超螺旋狀質(zhì)粒DNA居多,移動速度也最快。有時還會出現(xiàn)三條帶,其中一條是因為有一些質(zhì)粒DNA在提取過程中遭到損傷而線性化,其移動速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒DNA之間,所以該條電泳帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質(zhì)粒很好時,這條帶會很弱,有時看不到。
本實(shí)驗所用質(zhì)粒pCMV-Myc-T10經(jīng)EcoR1單酶切后應(yīng)為5.7kb;用EcoR1和Xho1雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA片段,一條是3.8kb,另一條是1.9kb(如下圖)。