當(dāng)目標(biāo)蛋白的物理特性如分子量、等電點(diǎn)等都不清楚時(shí)，可用PAGE電泳方法或?qū)游龇椒右詼y(cè)定。分離范圍廣闊的Superose HR適合測(cè)定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質(zhì)在多個(gè)含不同pH緩沖液的試管中，可簡(jiǎn)單地測(cè)出pI, 并確定純化用緩沖液的最佳pH。
選擇層析方法
在對(duì)目標(biāo)蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：
一、使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣泛的介質(zhì)如Superose、Sephacryl HR根據(jù)分子量將樣品分成不同組份。
二、用含專一配體或抗體的親和層析介質(zhì)結(jié)合目標(biāo)蛋白。也可用各種活化偶聯(lián)介質(zhì)偶聯(lián)目標(biāo)蛋白的底物、受體等自制親和介質(zhì)，再用以結(jié)合目標(biāo)蛋白。一部即可得到高純度樣品。
三、大體積的樣品、常使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。
純化大量粗品
處理大量原液時(shí)，為避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大顆粒離子交換介質(zhì)。擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)利用多種STREAMLINE截止，直接從含破碎細(xì)胞或組織萃取物的發(fā)酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結(jié)合為一，提高回收率，縮短純化周期。
純化硫酸氨樣品
硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經(jīng)處理過的樣本處于高鹽狀態(tài)下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，先用HiTrap HIC Test Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八種疏水介質(zhì)中選擇最適合介質(zhì)及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其他吸附性層析。
純化糖類分子
固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麥等的凝集素，結(jié)合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細(xì)胞膜組分、細(xì)胞、甚至亞細(xì)胞細(xì)胞器，純化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質(zhì)，可俘獲整個(gè)細(xì)胞或大復(fù)合物，如膜囊等。
純化膜蛋白
膜蛋白分離長(zhǎng)使用去污劑使其保持活性。離子性去污劑應(yīng)選用與目標(biāo)蛋白電荷相反者，以避免在作離子交換時(shí)蛋白競(jìng)爭(zhēng)交換介質(zhì)，藉此除去去污劑。非離子性去污劑可用疏水層析法除去。
純化單抗、抗原
單抗多為IgG，來源主要是腹水和混合瘤培養(yǎng)上清夜。腹水有大量白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和宿主抗體等。Protein G和ProteinA對(duì)IgG的Fc區(qū)有專一性親和作用，能一步醇化各種不同源的IgG。血清互補(bǔ)劑如小牛血清可先用蛋白G預(yù)處理，在培養(yǎng)前除去IgG。重組蛋白A介質(zhì)rProtein A Sepharose FF對(duì)IgG有更高的栽量和專一性，基團(tuán)脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose Hp或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。
疏水層析pheny1 Sepharose HP也很適合純化IgG。宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細(xì)純化中去除。
純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯(lián)介質(zhì)如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯(lián)IgG，再進(jìn)一步獲取IgG抗原。
HiTrap IgM是用來純化融合瘤細(xì)胞培養(yǎng)的單抗IgM，結(jié)合量達(dá)5mg IgM。HiTrap IgY是專門用來從蛋清里純化IgY，結(jié)合量達(dá)100 mg純IgY。
純化重組蛋白
重組蛋白在設(shè)計(jì)、構(gòu)建時(shí)應(yīng)已融化入純化構(gòu)想。樣品多夾雜了破碎細(xì)胞或溶解產(chǎn)物，擴(kuò)張柱床吸附技術(shù)STREAMLINE便很適合作粗分離。
純化包涵體蛋白
包涵體蛋白往往需溶于6M鹽酸胍或尿素中。高化學(xué)穩(wěn)定性的Sepharose12及Sepharose 6FF凝膠過濾介質(zhì)很適合在變性條件下做純化。變性純化后的蛋白質(zhì)需要復(fù)性至蛋白的天然構(gòu)象。Superdex75、Q Sepharose FF和pheny1 Sepharose FF 分別被發(fā)現(xiàn)有助包涵體蛋白的復(fù)性。一般包涵體蛋白樣品的純度越高復(fù)性效果越好。SOURCE 30 RPC反相層析介質(zhì)很適合純化復(fù)性前的粗品，并可以使1M NaOH重生。此方法純化后的包涵體蛋白，復(fù)性回收效率明顯提高。
包涵體蛋白固相復(fù)性
將包涵體蛋白在變性條件下固定（吸附）在層析介質(zhì)上，一般用Sepharose FF離子交換層析介質(zhì)。去除變性劑后，蛋白在介質(zhì)上成功復(fù)性，再將復(fù)性好的蛋白洗脫下來。固相復(fù)性避免了一般復(fù)性過程中蛋白聚體的形成，所以復(fù)性锝率更高，而且無(wú)需大量稀釋樣品，并將復(fù)性和初純化合二為一，大大節(jié)省時(shí)間及提高回收率。
固相復(fù)性方法也被用于以HiTrap Chelating金屬螯合層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的組胺酸融合蛋白；以及以HiTrap Heparin肝素親和層析直接復(fù)性及純化包涵體形式表達(dá)的含多個(gè)賴氨酸的融合蛋白。兩種親和層析預(yù)裝柱均可反復(fù)多次重復(fù)使用。
純化中草藥有效成分
中藥的化學(xué)成分極其復(fù)雜。傳統(tǒng)中藥多是前熬后服用，有效成分多為親水，包括生物堿、黃酮、蒽醌、皂甙、有機(jī)酸、多糖、肽和蛋白質(zhì)。靈活及綜合地利用多種層析方法，如離子交換、分子篩、反相層析，更容易分離到單一活性成分。Sephadex LH-20葡聚糖凝膠同時(shí)具備吸附性層析和分子篩選功能，例如，用甲醇分離黃酮甙，三糖甙先被洗下來，二糖甙其次，單糖甙隨后，最后是甙元。Sephadex LH-20可使用水、醇、丙酮、氯仿等各種試劑，廣泛用于各種天然產(chǎn)物的分離，包括生物堿、甙、黃酮、醌類、內(nèi)酯、萜類、甾類等。
生物堿在酸性緩沖液中帶正電，成為鹽，HiTrap SP陽(yáng)離子交換層析柱可以分離許多結(jié)構(gòu)非常相似的生物堿。相反，黃酮、醌類、皂甙、有機(jī)酸等可溶預(yù)溶于偏堿的緩沖液中，在HiTrap Q陰離子交換柱上分離效果良好。
一般多糖純化大多使用分子篩，如Sephadex，Sephacry1。若分子量在60萬(wàn)以下，并需更高等分辨率，可選擇新一代的Superdex。一種植物可能含水溶性、酸溶性、堿溶性多種多糖。綜合利用分子篩及離子交換層析有助進(jìn)一步獲各組分純品。另外，多糖藥物需去除可引起過敏反應(yīng)的蛋白質(zhì)，傳統(tǒng)Sevag方法用丁醇脫蛋白需數(shù)十次。陰陽(yáng)離子交換法可以一、兩步快速去除多糖中殘存的蛋白質(zhì)。 SURCE 5、15、30RPC反相層析也很適合各種中藥有效成分的檢測(cè)、分離和放大制備。由于中藥的成分非常復(fù)雜，SURCE反相層析可用范圍為PH1-14，并可用1M NaOH、1M HCI清洗、再生。比傳統(tǒng)硅膠反相層析更易于工藝優(yōu)化及在位清洗，壽命也更長(zhǎng)。
純化肽類
肽類的來源有天然萃取、合成肽和重組肽三種。肽容易被酶降解，但可以從有機(jī)溶劑或促溶劑中復(fù)性，所以以高選擇性的反相層析如Sephasil 、PepRPC、SOURCE 15RPC、SOURCE 5RPC或離子交換作純化。Superdex Peptide HR是專為肽分子純化設(shè)計(jì)的凝膠過濾預(yù)裝柱，能配合反相層析作出更精美的肽圖。肽分子制備可用離子交換配合凝膠過濾Superdex 30 PG。
純化核酸、病毒
核酸的純化用于去除影響測(cè)序或PCR污染物等研究。核酸可大致分為質(zhì)粒DNA、噬菌體DNA和PCR產(chǎn)物等。病毒也可視作核酸大分子，和質(zhì)粒DNA一樣，可用分離大分子的Sephacry S-1000 SF、Superose或Sepharoce 4FF凝膠過濾介質(zhì)去除雜蛋白，再配合離子交換如Mono Q、SOURCE Q分離核酸。
純化寡核苷酸
寡核苷酸多應(yīng)用在反義（anti-sense）DNA、RNA測(cè)序、PCR和cDNA合成等的研究。合成后含三苯甲基的寡聚核苷酸譯音離子、以陰離子交換的Mono Q或快速低反壓的SOURCE Q在PH12下可去除副產(chǎn)物，并避免凝集和保護(hù)基的脫落。載量大大高過反相層析，可用做大量制備。不含三苯甲基的失敗序列可用反相柱ProRPC去除。
脫鹽、小分子去處
使用凝膠過濾介質(zhì)Sephadex G10、G15、G25、G50等去除小分子，效率高，處理量可達(dá)床體積30%。只需在進(jìn)樣后收集1/3-1/2柱體積的洗脫液，就可以去除該填料分離范圍上限以下的小分子，簡(jiǎn)單直接。由于只是去除小分子，柱高10cm以上即可。整個(gè)過程一般可于數(shù)分鐘至半小時(shí)完成。Sephadex G25系列介質(zhì)專為蛋白質(zhì)脫鹽而設(shè)計(jì)，預(yù)裝柱HiTrap Desalting(5ml)可用針筒操作。HiTrap Desalting(26ml)可在數(shù)分鐘為多至10 ml樣品脫鹽。
疫苗純化
使用凝膠過濾介質(zhì)Sepharoce 4FF純化疫苗，去除培養(yǎng)基 雜蛋白，處理量可大于床體積10%。柱高一般40-70cm，整個(gè)過程約半至一小時(shí)。目前使用該方法生產(chǎn)的疫苗品種有乙肝、狂犬、出血熱、流感、肺結(jié)核、小兒麻痹疫苗等。分子量較小的疫苗可使用Sephacry S-500 HR，如甲肝疫苗等。
抗生素聚合物分析
《中國(guó)藥典》自2000年版起要求抗生素頭孢曲松鈉需要找出聚合物占產(chǎn)品的百分比，規(guī)定使用Sephadex G10凝膠過濾去測(cè)定。
