一、瓊脂糖凝膠的特點(diǎn)
天然瓊脂(agar)是一種多聚糖,主要由瓊脂糖(agarose,約占80%)及瓊脂膠(agaropectin)組成。瓊脂糖是由半乳糖及其衍生物構(gòu)成的中性物質(zhì),不帶電荷,而瓊脂膠是一種含硫酸根和羧基的強(qiáng)酸性多糖,由于這些基團(tuán)帶有電荷,在電場(chǎng)作用下能產(chǎn)生較強(qiáng)的電滲現(xiàn)象,加之硫酸根可與某些蛋白質(zhì)作用而影響電泳速度及分離效果。因此,目前多用瓊脂糖為電泳支持物進(jìn)行平板電泳,其優(yōu)點(diǎn)如下。
(1)瓊脂糖凝膠電泳操作簡單,電泳速度快,樣品不需事先處理就可以進(jìn)行電泳。
(2)瓊脂糖凝膠結(jié)構(gòu)均勻,含水量大(約占98%~99%),近似自由電泳,樣品擴(kuò)散較自由電流,對(duì)樣品吸附極微,因此電泳圖譜清晰,分辨率高,重復(fù)性好。
(3)瓊脂糖透明無紫外吸收,電泳過程和結(jié)果可直接用紫外光燈檢測(cè)及定量測(cè)定。
(4)電泳后區(qū)帶易染色,樣品極易洗脫,便于定量測(cè)定。制成干膜可長期保存。
目前,常用瓊脂糖作為電泳支持物,分離蛋白質(zhì)和同工酶。將瓊脂糖電泳與免疫化學(xué)相結(jié)合,發(fā)展成免疫電泳技術(shù),能鑒別其他方法不能鑒別的復(fù)雜體系,由于建立了超微量技術(shù),0.1ug蛋白質(zhì)就可檢出。
瓊脂糖凝膠電泳也常用于分離、鑒定核酸,如DNA鑒定,DNA限制性內(nèi)切核酸酶圖譜制作等。由于這種方法操作方便,設(shè)備簡單,需樣品量少,分辨能力高,已成為基因工程研究中常用實(shí)驗(yàn)方法之一。
二、DNA的瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳對(duì)核酸的分離作用主要是依據(jù)它們的相對(duì)分子量質(zhì)量及分子構(gòu)型,同時(shí)與凝膠的濃度也有密切關(guān)系。
1、核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系
(1)DNA分子的大小 在凝膠中,DNA片段遷移距離(遷移率)與堿基對(duì)的對(duì)數(shù)成反比,因此通過已知大小的標(biāo)準(zhǔn)物移動(dòng)的距離與未知片段的移動(dòng)距離時(shí)行比較,便可測(cè)出未知片段的大小。但是當(dāng)DNA分子大小超過20kb時(shí),普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時(shí)電泳的遷移率不再依賴于分子大小,因此,就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時(shí),分子大小不宜超過此值。
(2)瓊脂脂糖的濃度 如下表所示,不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離。
表 瓊脂糖濃度與DNA分離范圍
瓊脂糖濃度 /% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
線狀DNA大小/kb 60-5 20-1 10-0.8 7-0.5 6-0.4 4-0.2 3-0.1
2、核酸構(gòu)型與瓊脂糖凝膠電泳分離的關(guān)系
不同構(gòu)型DNA的移動(dòng)速度次序?yàn)椋汗﹥r(jià)閉環(huán)DNA(covalently closed circular,cccDNA)>直線DNA>開環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA。當(dāng)瓊脂糖濃度太高時(shí),環(huán)狀DNA(一般為球形)不能進(jìn)入膠中,相對(duì)遷移率為0(Rm=0),而同等大小的直線雙鏈DNA(剛性棒狀)則可以長軸方向前進(jìn)(Rm>0),由此可見,這三種構(gòu)型的相對(duì)遷移率主要取決于凝膠濃度,但同時(shí),也受到電流強(qiáng)度、緩沖液離子強(qiáng)度等的影響。
3、電泳方法
(1)凝膠類型
用于分離核酸的瓊脂糖凝膠電泳可分為垂直型及水平型(平板型)。水平型電泳時(shí),凝膠板完全浸泡在電極緩沖液下1-2mm,故又稱為潛水式。目前更多用的是后者,因?yàn)樗颇z和加樣比較方便,電泳槽簡單,易于制作,又可以根據(jù)需要制備不同規(guī)格的凝膠板,節(jié)約凝膠,因而較受歡迎。
(2)緩沖液系統(tǒng)
缺少離子時(shí),電流太小,DNA遷移慢;相反,高離子強(qiáng)度的緩沖液由于電流太大會(huì)大量產(chǎn)熱,嚴(yán)重時(shí),會(huì)造成膠熔化和DNA的變性。
常用的電泳緩沖液有EDTA(pH8.0)和Tris-乙酸(TEA),Tris-硼酸(TBE)或Tris-磷酸(TPE)等,濃度約為50mmol/L(pH7.5~7.8)。電泳緩沖液一般都配制成濃的貯備液,臨用時(shí)稀釋到所需倍數(shù)。
TAE緩沖能力較低,后兩者有足夠高的緩沖能力,因此更常用。TBE濃溶液長期貯存會(huì)出現(xiàn)沉淀,為避免此缺點(diǎn),室溫下貯存5×溶液,用時(shí)稀釋10倍0.5×工作溶液即能提供足夠緩沖能力。
(3)凝膠的制備
以稀釋的電極緩沖液為溶劑,用沸水浴或微波爐配制一定濃度的溶膠,灌入水平膠框或垂直膠膜,插入梳子,自然冷卻。
(4)樣品配制與加樣
DNA樣品用適量Tris-EDTA緩沖液溶解,緩沖液內(nèi)含有0.25%溴酚藍(lán)或其他指示染料,含有10%-15%蔗糖或5%~10%甘油,以增加其比重,使樣品集中。為避免蔗糖或甘油可能使電泳結(jié)果產(chǎn)生U形條帶,可改用2.5%Ficoll(聚蔗糖)代替蔗糖或甘油。
(5)電泳
瓊脂糖凝膠分離大分子DNA實(shí)驗(yàn)條件的研究結(jié)果表明,在低濃度、低電壓下,分離效果較好。在低電壓條件下,線性DNA分子的電泳遷移率與所用的電壓呈正比。但是,在電場(chǎng)強(qiáng)度增加時(shí),較大的DNA片段遷移率的增加相對(duì)較小。因此隨著電壓的增高,電泳分辨率反而下降,為了獲得電泳分離DNA片段的最大分辨率,電場(chǎng)強(qiáng)度不宜高于5V/cm。
電泳系統(tǒng)的溫度對(duì)于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進(jìn)行電泳,只有當(dāng)凝膠濃度低于0.5%時(shí),為增加凝膠硬度,可在4℃進(jìn)行電泳。
(6)染色和拍照
常用熒光染料溴乙錠(EB)染色,在紫外光下觀察DNA條帶,用紫外分析儀拍照,或用凝膠成像系統(tǒng)輸出照片,并進(jìn)行有關(guān)的數(shù)據(jù)分析。
三、印跡轉(zhuǎn)移電泳
生物化學(xué)與分子生物學(xué)的研究工作經(jīng)常需要對(duì)電泳分離后的DNA進(jìn)行分子雜交,但瓊脂糖不適合于進(jìn)行雜交操作,1975年,Southren創(chuàng)造了將DNA區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸基纖維素膜(NC膜)上,再進(jìn)行雜交的方法,被稱為Southren印跡法。隨后,Alwine等將類似方法用于RNA印跡,被戲稱為Northern印跡,1979年Towbin等設(shè)計(jì)了將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜的裝置,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上,再與相應(yīng)的抗體等配體反應(yīng),被戲稱為Western印跡,這種裝置將膜和凝膠、濾紙等制成夾心餅干狀,用低電壓高電流電泳完成轉(zhuǎn)移。1982年Reinhart等用電轉(zhuǎn)移法將等電聚焦后的蛋白質(zhì)區(qū)帶從凝膠轉(zhuǎn)移到特定膜上,稱Eastern印跡。
目前國內(nèi)外有多種核酸、蛋白質(zhì)印跡轉(zhuǎn)移的電泳裝置出售,使印跡轉(zhuǎn)移速度快效率高、重復(fù)性好,應(yīng)用更加廣泛。聚丙烯酰胺凝膠也可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳,但轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)時(shí),凝膠中不可含有SDS、尿素等變性劑。用于轉(zhuǎn)移電泳的支持膜亦有多種選擇,近些年用尼龍膜較多,因?yàn)槟猃埬C(jī)械性能好,烘烤不變脆,使用時(shí)比硝酸纖維素膜更方便。
進(jìn)行印跡轉(zhuǎn)移電泳時(shí),要注意緩沖液的離子強(qiáng)度要低,pH要遠(yuǎn)離pI,使蛋白質(zhì)帶有較多電荷,一般用穩(wěn)定性較好的Tris-緩沖體系。還要注意凝膠與支持膜之間有能有氣泡。適當(dāng)提高電壓或電流可以提高轉(zhuǎn)移速度,但亦會(huì)增加熱效應(yīng),故電壓或電流不可過高。
四、交變脈沖電場(chǎng)凝膠電泳
一般瓊脂糖凝膠電泳只能分離小于20kb的DNA。這是因?yàn)樵诃傊悄z中,DNA分子的有效直徑超過凝膠孔徑時(shí),在電場(chǎng)作用下,迫使DNA變形擠過篩孔,而沿著泳動(dòng)方向伸直,因而分子大小對(duì)遷移率影響不大。如此時(shí)改變電場(chǎng)方向,則DNA分子必須改變其構(gòu)象,沿新的泳動(dòng)方面伸直,而轉(zhuǎn)向時(shí)間與DNA分子大小關(guān)系極為密切。1983年Schwartz等人根據(jù)DNA分子彈性弛豫時(shí)間(外推為0的滯留時(shí)間)與DNA分子大小有關(guān)的特性,設(shè)計(jì)了脈沖電場(chǎng)梯度凝膠,交替采用兩個(gè)垂直方向的不均勻電場(chǎng),使DNA分子在凝膠中不斷改變方向,從而使DNA按分子大小分開。后來Carle等改進(jìn)了電泳技術(shù),并發(fā)現(xiàn)周期性的反轉(zhuǎn)換電場(chǎng)(periodic inversion of the electric field)亦能使大分子DNA通過電泳分開。電泳系統(tǒng)是由一水平式電泳槽和兩組獨(dú)立、彼此垂直的電極組成,一組電極負(fù)極為N,正極為S;另一組負(fù)極為W,正極為E。一塊正方形瓊脂糖凝膠板(10cm*10cm或20cm*20cm)呈45度放中央。電場(chǎng)在N-S和W-E之間交替建立。電場(chǎng)交替改變的時(shí)間長短與欲分離的DNA分子大小有關(guān)。電泳時(shí),DNA分子處在連續(xù)間隔交替的電場(chǎng)中。首先向S極移動(dòng),然后改向E極。在每次電場(chǎng)方向改變時(shí),DNA分子就要有一定的時(shí)間松弛,改變形狀和遷移方向。只有當(dāng)DNA分子達(dá)到一定構(gòu)型后,才能繼續(xù)前時(shí)。DNA分子凈移動(dòng)方向與加樣線垂直,使樣品中各組分沿同一泳道形成各自的區(qū)帶。交變脈沖電泳可有效分離數(shù)百萬堿基對(duì)的大分子DNA。較新式的儀器電極間的角度和脈沖時(shí)間均可調(diào),使用更加方便。
此外,瓊脂糖平板常用于免疫擴(kuò)散技術(shù)的電泳技術(shù)相結(jié)合的多種免疫電泳。