總RNA(total RNA)和信使RNA(mRNA)的抽提(自己的總結(jié))
1、實驗?zāi)康?br />提取人體細(xì)胞的總RNA和mRNA。
2、本實驗所需試劑
1)、CNE-2細(xì)胞及培養(yǎng)細(xì)胞的一系列條件,
2)、PBS緩沖液, TRIZOL試劑,
3)、DEPC處理過的水、大、中、小Tip及1.5 ml EP管,
4)、新的氯仿、異丙醇和乙醇,
5)、mRNA分離試劑盒:Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN。
6)、新配的電泳緩沖液,專跑RNA的瓊脂糖(Agarose)。
3、實驗流程(掌握內(nèi)容)
3.1 細(xì)胞總RNA的提取
1)、6孔板細(xì)胞(CNE-2)匯合度為90-100%時,取出無菌室,去其上清,用PBS洗兩次后,每孔加TRIZOL試劑(Gibco公司) 1 ml,搖勻,無菌罩內(nèi)消化3-5分鐘(觀察:液體變粘稠,細(xì)胞脫壁)。
2)、將各孔內(nèi)消化好的細(xì)胞裂解液吸到一DEPC處理過的1.5 ml EP管中,加新開的氯仿0.2 ml,輕搖15秒。
3)、室溫靜置2-3分鐘后,12000 rpm,15 min,4℃,離心。然后取上清無色水相(約0.6 ml)到 EP管(DEPC處理過),加0.5 ml新開的異丙醇,室溫下靜置10分鐘。
4)、12000 rpm,10分鐘,4℃,離心。觀察總RNA在管底的白色沉淀,棄去上清(小心別丟了沉淀),75%乙醇1.0 ml洗滌(用DEPC水新配制)后,7500 rpm,5 min,4℃離心。
5)、去上清,點離,用小Tip吸干液體。氣干沉淀5-10分鐘, DEPC處理水20-30 ul加入,中槍打勻,55-60℃水浴10分鐘溶解總RNA,測OD值。
6)、電泳。
3.2 從總RNA中分離mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022, QIAGEN)
1)、取上述提取的總RNA若干(少于0.25 mg)到一個新的無RNase 的EP管中,用無RNase的水定容到250 ul。
2)、加入Buffer OBB 250 ul, Oligotex Suspension 15 ul。用Tip打勻或用手彈勻。
3)、70℃水浴,3分鐘(裂解RNA的二級結(jié)構(gòu))。
4)、20-30℃條件下,靜置10分鐘(讓Oligotex與mRNA結(jié)合)。
5)、高速離心2分鐘,小心吸走上清(該上清要保留),留下約50 ul的上清在原管里。
6)、用Buffer OW2 400 ul重懸含Oligotex/mRNA復(fù)合物的沉淀,然后將這些加到套有1.5 ml EP管的SPIN柱子上,高速離心1分鐘。
7)、將SPIN柱子移到一個新的EP管上,加Buffer OW2 400 ul到柱子,高速離心1分鐘,丟掉濾過液。
8)、將SPIN柱子移到一個新的EP管上,加20-100 ul熱的(70℃)Buffer OEB到柱子上,用Tip來回吸打3-4次,高速離心1分鐘。
9)、為保證最大的 mRNA產(chǎn)量,可再次重復(fù)第8步。
10)、電泳。
4、mRNA的應(yīng)用(了解內(nèi)容):
RT-PCR, Northern雜交,cDNA文庫構(gòu)建, mRNA末端快速擴增(RACE),差異表達(DDRT-PCR),引物延伸反應(yīng)(Primer Extension),體外轉(zhuǎn)錄(In Vitro RNA Transcription), RNA標(biāo)記(RNA labeling),RNA酶保護試驗(RNase and S1 Nuclease Protection Assay),RNA微注射(RNA Microinjection)