基因是染色體上具有一定座位的遺傳單位，是DNA分子中一定長度的核苷酸序列。植物的生長發(fā)育是在多種代謝和生理過程基礎上所發(fā)生的基因在時空上表達的綜合現(xiàn)象，開發(fā)和分離潛在的各種有價值的基因并深入研究其表達機理，對作物品種的改良具有重要意義。因此對植物基因的克隆并發(fā)展與之相關的技術已引起人們的日益關注和投入，近年來其研究方法不斷改進，新技術不斷涌現(xiàn)，這為進一步研究諸如各種調節(jié)植物生長發(fā)育的基因、逆境與防御反應的基因、植物細胞凋亡的基因等提供了新的途徑。
一、常用的目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定
這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，并對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當其他植物的同類基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時，也可直接用這些已知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物基因文庫進行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
�。�1）基因標鑒法。該法是利用轉座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產生一些突變體，然后用相應轉座子或T-DNA對突變體文庫進行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉位因子插入到某一特定基因序列中導致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構建基因文庫，然后將轉位因子用同位素標記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關的Viviparious-1基因及與金魚草花發(fā)育有關的一些基因等。
�。�2）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術。該技術是利用病菌無毒基因（avrgene）編碼的激發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親和的互作關系，以病原激發(fā)子蛋白為線索分離和克隆出一些幾丁質抗病基因，如番茄與無毒基因avr9對應的抗病基因cf9，與avrPto對應的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對應的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎的定位克隆技術
以圖譜為基礎的定位克隆技術在分離未知產物的基因方面有廣闊的應用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標記如RFLP等為起點，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標基因定位在高密度的分子標記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標記的遺傳圖譜距轉換成物理距離；（3）構建YAC文庫，找到含連鎖標記的YAC克隆，并通過克隆的排序獲得目標基因的DNA片段；（4）通過轉化和功能互補試驗證實基因所在的DNA片段。如用該技術已分離出番茄抗根結線蟲mi基因和擬南芥菜抗細菌性莖腐病的RPM1基因等。
二、發(fā)展中的基因克隆新技術
1、從研究缺失突變體的表型著手分離基因
�。�1）核DNA消減法。該法主要是利用許多缺失突變體與其未缺失的同源親本只有1-2個DNA片段的差異，通過將大量特殊標記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混合，變性后在適當溫度下復性，待反應體系中的單鏈DNA重新配對成雙鏈后，除去標記的突變體DNA和與之雜交配對的親本DNA。如此幾輪選擇后，反應體系中最后只剩下在突變體核DNA中所缺失的那一段親本DNA，最后對親本特異DNA片段進行克隆。
(2)核DNA消減--PCR法。該法是核DNA消減法的發(fā)展，它將經特定限制性內切酶處理的未缺失親本DNA（備測DNA）與大量經超聲波切割、光敏生物素標記的突變體DNA(減法探針DNA)混合，經變性復性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球懸浮液除去各種雜合體，富集的親本特異性DNA再經幾輪篩選后加接頭序列和T4DNA連接酶，然后加入單鏈接頭序列作PCR引物進行PCR擴增，最后PCR產物直接克隆或32P標記后作探針與親本DNA或核DNA文庫雜交，確定出這些DNA片段所編碼的基因，應用上述方法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關的基因gal以及冰草的鹽脅迫誘導基因等。
2、從大的基因組區(qū)域直接分離編碼序列
真核生物基因組DNA中只有很小一部分編碼mRNA，而大部分則為內含子、外顯子和重復序列，目前通過大規(guī)�；蚪M測序來尋找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分離表達序列的方法中，cDNA捕捉法是較成功的一種方法，已用于許多基因的定位克隆。
�。╨）cDNA文庫差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達基因的方法，例如對于兩種不同的組織細胞，先提取它們的poly(A) mRNA，分別構建這兩種組織的cDNA文庫，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標記的cDNA探針，再用這兩種探針分別與一類cDNA文庫的兩套重復考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細胞中都表達的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細胞中特異表達的mRNA，再對這樣的克隆進行測序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達的基因。用這種方法已分離到許多根莖葉和生殖器官等特異表達的基因。
(2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一種以表達為基礎的基因分離技術。它直接用基因組DNA如酵母人工染色體(YACs)捕捉cDNA片段，從而達到快速地從大的基因組區(qū)域分離表達序列。其主要技術是用PCR擴增來自不同組織的混合cDNA池或已克隆的cDNA文庫，擴增的cDNA片段與用生物素隨機標記的基因組目標DNA雜交，捕獲親和素標記磁珠上的與目標DNA雜交的cDNA片段，然后洗脫磁缽上捕獲的cDNA并進行PCR擴增，再進行第二輪篩選，并將篩選出的cDNA片段克隆到載體上。
3、通過研究mRNA差異表達篩選克隆基因
1992年粱鵬等在mRNA差異表達通用方法即mRNA差減雜交技術基礎上建立了mRNA差異顯示反轉錄PCR技術(DDRT-PCR)，由于該技術所存在的缺陷和不足，已有許多研究在引物設計、Northern雜交和凝膠測序等方面對該技術進行了改進和優(yōu)化，已發(fā)展了許多衍生的新技術，如用隨機引物PCR擴增RNA指紋分析(RAP)、順次差異顯示法(ODD)、基因組差異顯示法(GDD)、RC4D(RFLP一Coupled domain一direted DD)等。
mRNA的差異顯示法已在發(fā)育和生理過程中差異表達基因的克隆方面得到廣泛的應用，特別適用于進行數(shù)種平行材料之間的比較篩選。應用RC4D法可分析植物發(fā)育過程中某一組織的某一特定多基因家族不同成員的差異表達，如已從玉米花序中分離出6個雌雄花序中差異表達的MAD-box基因，從小麥和擬南芥中分別分離出HSP家族基因。
4、表型克隆法
表型克隆法是以mRNA為起始材料，利用RT-PCR和接頭技術，對差異顯示的基因帶紋進行回收后作探針，在cDNA或基因組DNA文庫中掃描篩選新的基因。這方面最新發(fā)展起來的技術主要有：cDNA差式分析法(RDA)、標簽接頭競爭PCR技術（ATAC一PCR）、抑制消減雜交法(SSH)、基因表達連續(xù)分析法(SAGE)、cDNA3端限制酶切片段顯示法(RFD)等，這些技術省去了分子標記定位分析的繁瑣程序，并同時能分離多個未知產物的差異表達基因。
5、應用DNA芯片技術篩選新基因
DNA芯片技術是利用核酸雜交原理檢測未知分子。它是由核酸片段如一系列用特定熒光標記的寡核苷酸探針，以預先設計排列方式固定在載玻片或尼龍膜上組成生物集成膜片，與不同標記的游離靶分子（DNA 或RNA）雜交，或生物集成膜片上的不同靶分子與游離的探針雜交，然后應用熒光信號檢測器及處理器根據(jù)雜交分子或未雜交分子所發(fā)出的不同波長的光檢測雜交信號。如完全雜交則發(fā)出強的熒光信號或特殊波長信號，不完全雜交信號較弱，若不能雜交則檢測不到熒光信號或只檢測到芯片上原有熒光信號。這些不同區(qū)域的熒光信號在芯片上組成熒光分布譜型，可被激光共聚焦顯微鏡激發(fā)和檢測，經電腦軟件處理檢出DNA的序列及其變化。例如斯坦福大學從外周血淋巴細胞cDNA文庫中用PCR法擴增插入基因，得到1046種未知序列擴增產物，將這些擴增產物作為靶DNA點樣到經包被的玻片上，制成DNA芯片，經SDS、NaBH4等處理，95℃熱變性后分別與熱擊T細胞及未處理T細胞的cDNA雜交，經激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個差異表達的基因，其中11個是被熱誘導的，其余6個是被熱擊抑制的，經序列分析表明其中3個為未發(fā)現(xiàn)的新基因。植物上最近已有應用cDNA芯片對草莓、矮牽牛進行基因表達的檢測。
DNA芯片技術在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個基因在不同時空表達方面是一項十分有用的技術，已有學者對其在農業(yè)上的應用作了展望，如應用DNA芯片技術有望更深入地了解植物生長發(fā)育的內在機制、植物生長激素的作用機制、轉基因工程株的實驗室快速分析、了解小分子對基因表達的影響及加速DNA多態(tài)性的檢測等。
綜上所述的各種植物未知基因分離克隆技術，其研究和分析對象各有側重且各有優(yōu)缺點，有的在植物基因資源的研究開發(fā)上應用比較成熟，有的正逐漸應用到植物上。毫無疑問，發(fā)展中的這些植物基因分離技術在植物的分子生物學和基因工程中有著巨大的應用潛能，隨著新的基因資源的不斷發(fā)掘，作物的許多性狀諸如產量、品質、抗性，植株的形態(tài)、熟期、花器發(fā)育的調節(jié)，以及一些復雜的生理生化性狀等都可望得到進一步的改良。
一、常用的目的基因克隆技術
1、通過已知基因產物的分析和鑒定
這類技術主要通過生物化學和病理學研究分離鑒定有關基因的蛋白產物，并對蛋白質氨基酸順序進行分析，推斷出編碼該蛋白質的基因序列，然后通過抗體、寡聚核苷酸探針或PCR制備的探針對文庫進行篩選來分離目的基因。如植物抗病蟲基因工程中常用的蘇云金桿菌殺蟲晶體蛋白基因（Bt基因）、豇豆胰蛋白酶抑制基因（CpTI基因）、病毒外殼蛋白基因（CP基因）等。當其他植物的同類基因已分離到并且核苷酸序列保守性較高時，也可直接用這些已知的基因片段作探針對未克隆到該基因的植物基因文庫進行篩選，也可分離到未知的新基因。
2、通過遺傳表型分析
�。�1）基因標鑒法。該法是利用轉座子或T-DNA插入植物的基因組中引起某一基因失活產生一些突變體，然后用相應轉座子或T-DNA對突變體文庫進行篩選，以選到的陽性克隆片段為探針，再篩選野生型植物因文庫分離目的基因。如將一株帶有功能的轉位因子系統(tǒng)的植物與另一株在遺傳上有差異的同種植物雜交，在雜交后代中篩選由于轉位因子插入到某一特定基因序列中導致表型破壞或改變的突變株，用該純合突變株構建基因文庫，然后將轉位因子用同位素標記作探針，從該文庫中篩選出帶有同源轉位因子的目的基因。該法主要限于二倍體的自花授粉作物如玉米、金魚草等。應用該法已分離出與玉米種子發(fā)育有關的Viviparious-1基因及與金魚草花發(fā)育有關的一些基因等。
�。�2）激發(fā)子的寄主受體基因克隆技術。該技術是利用病菌無毒基因（avrgene）編碼的激發(fā)子與寄主抗病基因編碼的受體之間存在不親和的互作關系，以病原激發(fā)子蛋白為線索分離和克隆出一些幾丁質抗病基因，如番茄與無毒基因avr9對應的抗病基因cf9，與avrPto對應的抗病基因pto；擬南芥菜與avrRPS2對應的抗病基因rpS2等。
3、以圖譜為基礎的定位克隆技術
以圖譜為基礎的定位克隆技術在分離未知產物的基因方面有廣闊的應用前景。該法的基本前提是基因定位，然后以緊密連鎖的分子標記如RFLP等為起點，通過染色體步移逐步向目標基因靠近，最終克隆基因。其主要步驟包括：（1）將目標基因定位在高密度的分子標記連鎖群上；（2）利用PFGE將連銷標記的遺傳圖譜距轉換成物理距離；（3）構建YAC文庫，找到含連鎖標記的YAC克隆，并通過克隆的排序獲得目標基因的DNA片段；（4）通過轉化和功能互補試驗證實基因所在的DNA片段。如用該技術已分離出番茄抗根結線蟲mi基因和擬南芥菜抗細菌性莖腐病的RPM1基因等。
二、發(fā)展中的基因克隆新技術
1、從研究缺失突變體的表型著手分離基因
�。�1）核DNA消減法。該法主要是利用許多缺失突變體與其未缺失的同源親本只有1-2個DNA片段的差異，通過將大量特殊標記的突變體DNA與少量未缺失親本DNA相混合，變性后在適當溫度下復性，待反應體系中的單鏈DNA重新配對成雙鏈后，除去標記的突變體DNA和與之雜交配對的親本DNA。如此幾輪選擇后，反應體系中最后只剩下在突變體核DNA中所缺失的那一段親本DNA，最后對親本特異DNA片段進行克隆。
(2)核DNA消減--PCR法。該法是核DNA消減法的發(fā)展，它將經特定限制性內切酶處理的未缺失親本DNA（備測DNA）與大量經超聲波切割、光敏生物素標記的突變體DNA(減法探針DNA)混合，經變性復性后加抗生物素蛋白包裹的多聚乙烯小球懸浮液除去各種雜合體，富集的親本特異性DNA再經幾輪篩選后加接頭序列和T4DNA連接酶，然后加入單鏈接頭序列作PCR引物進行PCR擴增，最后PCR產物直接克隆或32P標記后作探針與親本DNA或核DNA文庫雜交，確定出這些DNA片段所編碼的基因，應用上述方法已分離出擬南芥菜與赤霉素合成有關的基因gal以及冰草的鹽脅迫誘導基因等。
2、從大的基因組區(qū)域直接分離編碼序列
真核生物基因組DNA中只有很小一部分編碼mRNA，而大部分則為內含子、外顯子和重復序列，目前通過大規(guī)�；蚪M測序來尋找和克隆新基因尚不可行。在已有一些分離表達序列的方法中，cDNA捕捉法是較成功的一種方法，已用于許多基因的定位克隆。
�。╨）cDNA文庫差示篩選法，這是一種直接分離組織或發(fā)育特異表達基因的方法，例如對于兩種不同的組織細胞，先提取它們的poly(A) mRNA，分別構建這兩種組織的cDNA文庫，然后以這些mRNA為模板，合成放射性標記的cDNA探針，再用這兩種探針分別與一類cDNA文庫的兩套重復考貝雜交，跟兩種探針都雜交的克隆是兩種組織細胞中都表達的基因，而僅與一種探針雜交的克隆則是在一種組織細胞中特異表達的mRNA，再對這樣的克隆進行測序比較和鑒定，就可分離到這種組織特異表達的基因。用這種方法已分離到許多根莖葉和生殖器官等特異表達的基因。
(2)cDNA捕捉法。cDNA捕捉法是一種以表達為基礎的基因分離技術。它直接用基因組DNA如酵母人工染色體(YACs)捕捉cDNA片段，從而達到快速地從大的基因組區(qū)域分離表達序列。其主要技術是用PCR擴增來自不同組織的混合cDNA池或已克隆的cDNA文庫，擴增的cDNA片段與用生物素隨機標記的基因組目標DNA雜交，捕獲親和素標記磁珠上的與目標DNA雜交的cDNA片段，然后洗脫磁缽上捕獲的cDNA并進行PCR擴增，再進行第二輪篩選，并將篩選出的cDNA片段克隆到載體上。
3、通過研究mRNA差異表達篩選克隆基因
1992年粱鵬等在mRNA差異表達通用方法即mRNA差減雜交技術基礎上建立了mRNA差異顯示反轉錄PCR技術(DDRT-PCR)，由于該技術所存在的缺陷和不足，已有許多研究在引物設計、Northern雜交和凝膠測序等方面對該技術進行了改進和優(yōu)化，已發(fā)展了許多衍生的新技術，如用隨機引物PCR擴增RNA指紋分析(RAP)、順次差異顯示法(ODD)、基因組差異顯示法(GDD)、RC4D(RFLP一Coupled domain一direted DD)等。
mRNA的差異顯示法已在發(fā)育和生理過程中差異表達基因的克隆方面得到廣泛的應用，特別適用于進行數(shù)種平行材料之間的比較篩選。應用RC4D法可分析植物發(fā)育過程中某一組織的某一特定多基因家族不同成員的差異表達，如已從玉米花序中分離出6個雌雄花序中差異表達的MAD-box基因，從小麥和擬南芥中分別分離出HSP家族基因。
4、表型克隆法
表型克隆法是以mRNA為起始材料，利用RT-PCR和接頭技術，對差異顯示的基因帶紋進行回收后作探針，在cDNA或基因組DNA文庫中掃描篩選新的基因。這方面最新發(fā)展起來的技術主要有：cDNA差式分析法(RDA)、標簽接頭競爭PCR技術（ATAC一PCR）、抑制消減雜交法(SSH)、基因表達連續(xù)分析法(SAGE)、cDNA3端限制酶切片段顯示法(RFD)等，這些技術省去了分子標記定位分析的繁瑣程序，并同時能分離多個未知產物的差異表達基因。
5、應用DNA芯片技術篩選新基因
DNA芯片技術是利用核酸雜交原理檢測未知分子。它是由核酸片段如一系列用特定熒光標記的寡核苷酸探針，以預先設計排列方式固定在載玻片或尼龍膜上組成生物集成膜片，與不同標記的游離靶分子（DNA 或RNA）雜交，或生物集成膜片上的不同靶分子與游離的探針雜交，然后應用熒光信號檢測器及處理器根據(jù)雜交分子或未雜交分子所發(fā)出的不同波長的光檢測雜交信號。如完全雜交則發(fā)出強的熒光信號或特殊波長信號，不完全雜交信號較弱，若不能雜交則檢測不到熒光信號或只檢測到芯片上原有熒光信號。這些不同區(qū)域的熒光信號在芯片上組成熒光分布譜型，可被激光共聚焦顯微鏡激發(fā)和檢測，經電腦軟件處理檢出DNA的序列及其變化。例如斯坦福大學從外周血淋巴細胞cDNA文庫中用PCR法擴增插入基因，得到1046種未知序列擴增產物，將這些擴增產物作為靶DNA點樣到經包被的玻片上，制成DNA芯片，經SDS、NaBH4等處理，95℃熱變性后分別與熱擊T細胞及未處理T細胞的cDNA雜交，經激光共聚焦掃描系統(tǒng)分析，共發(fā)現(xiàn)17個差異表達的基因，其中11個是被熱誘導的，其余6個是被熱擊抑制的，經序列分析表明其中3個為未發(fā)現(xiàn)的新基因。植物上最近已有應用cDNA芯片對草莓、矮牽牛進行基因表達的檢測。
DNA芯片技術在發(fā)現(xiàn)新基因及分析各個基因在不同時空表達方面是一項十分有用的技術，已有學者對其在農業(yè)上的應用作了展望，如應用DNA芯片技術有望更深入地了解植物生長發(fā)育的內在機制、植物生長激素的作用機制、轉基因工程株的實驗室快速分析、了解小分子對基因表達的影響及加速DNA多態(tài)性的檢測等。
綜上所述的各種植物未知基因分離克隆技術，其研究和分析對象各有側重且各有優(yōu)缺點，有的在植物基因資源的研究開發(fā)上應用比較成熟，有的正逐漸應用到植物上。毫無疑問，發(fā)展中的這些植物基因分離技術在植物的分子生物學和基因工程中有著巨大的應用潛能，隨著新的基因資源的不斷發(fā)掘，作物的許多性狀諸如產量、品質、抗性，植株的形態(tài)、熟期、花器發(fā)育的調節(jié)，以及一些復雜的生理生化性狀等都可望得到進一步的改良。
