基因工程又叫做基因拼接技術(shù)或DNA重組技術(shù)。這種技術(shù)是在生物體外,通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪接”和“拼接”,對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合,然后導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行無性繁殖,使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá),產(chǎn)生出人類所需要的基因產(chǎn)物。
基因工程的第一步是獲得符合人類意愿的基因“目的基因”,常用的工具酶是限制性內(nèi)切酶,限制性內(nèi)切酶的種類很多,但一種限制性內(nèi)切只能識別一種特定的核苷酸序列,并且在特定切點(diǎn)上切割DNA分子,如從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的一種限制性內(nèi)切酶只能識別GATTC序列,并在G和A之間將這段序列切開。直接分離基因的最常用的方法是“鳥槍法”即用限制性內(nèi)切酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段,將這些片段分別載入運(yùn)載體,然后通過運(yùn)載體分別轉(zhuǎn)入不同的受體細(xì)胞,讓供體細(xì)胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分別在各個細(xì)胞中大量復(fù)制,從中找出含有基因的細(xì)胞,再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡便,缺點(diǎn)是工作量大,具有一定的盲目性。在獲取真核細(xì)胞中的DNA時,“鳥槍法”就不太適用了,原因是真核細(xì)胞的基因含有不表達(dá)的DNA片段,不能直接用于基因的擴(kuò)增和表達(dá),所以在獲取真核細(xì)胞中的基因時,常用的方法是人工合成基因的方法。人工合成基因的方法主要有兩條途徑:一是以目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA為模板,逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA,然后在酶的作用下合成雙鏈DNA,從而獲得所需要的基因;二是根據(jù)已知的蛋白質(zhì)的氨基酸序列,推測出相應(yīng)的 mRNA序列,然后按堿基互補(bǔ)配對原則,推測出它的結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列,再通過化學(xué)的方法,以單核苷酸為原料合成目的基因,如人的血紅蛋白基因胰島素基因等就是通過這種方法獲得的。
基因工程的第二步是把目的基因接到某種運(yùn)載體上,常用的運(yùn)載體是能夠和細(xì)菌共生的質(zhì)粒等,具體做法是:先用限制性內(nèi)切酶切斷目的基因,使其產(chǎn)生相同的黏性末。將切下的目的基因的片段插入到質(zhì)粒的切口處,現(xiàn)再加人適量的DNA連接酶,質(zhì)粒的黏性末端與目的基因DNA片段的黏性末端就會因堿基配對而結(jié)合,形成一個重組DNA分子。如人的胰島素基因質(zhì)粒的結(jié)合就是通過這種方式實現(xiàn)的。
基因工程的第三步是通過運(yùn)載體把目的基因帶入某生物體內(nèi),并使它得到表達(dá)。在基因工程中常用的受體細(xì)胞有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、動植物細(xì)胞等。目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后,就可以隨著受體細(xì)胞的繁殖而復(fù)制。
基因工程的第四步是目的基因的檢測和表達(dá)。在基因工程的前三步完成后,在全部受體細(xì)胞中,真正能夠攝入重組DNA分子的受體細(xì)胞是很少的。因此,必須通過一定的手段對細(xì)胞中是否導(dǎo)入了目的基因進(jìn)行檢測。檢測的方法有很多種,如大腸桿菌的某種質(zhì)粒具有青霉素抗性基因,當(dāng)這種質(zhì)粒與外源DNA組合在一起形成重組質(zhì)粒,并被轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后,就可以根據(jù)受體是否具有青霉素抗來判斷受體細(xì)胞是否獲得了目的基因。