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常用標記免疫酶及其底物

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

1.標記酶的選擇條件

活性高,分解底物的能力強。

特異性強,即作用于底物的專一性強。

與抗原抗體結(jié)合后仍保持酶的活性。

與底物作用可以顯色。

純度高、易純化,即含雜蛋白少。

可溶性(水溶性)好,在溶液中穩(wěn)定。

測定方法簡單。

酶來源方便、價格低廉。

2.符合條件的酶

辣根過氧化物酶(Horseradish peroxidase HRP),分子量40 000

堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase AKP),分子量82 000。

⑶ β-半乳糖甙酶(β-galactosidase),分子量540 000。

⑷ 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase,分子量186 000。

其中以HRP最為常用,因其具有活力高、穩(wěn)定、分子量小、易提純等優(yōu)點。

3.辣根過氧化物酶 HRP廣泛地分布于植物界,以辣根中含量最高。它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉輔基組成的一種糖蛋白,含糖量18%,它由300個氨基酸和4個二硫鍵連接而成。分子量40 000,等電點5.59.0之間,它催化的最適pH因供氫體不同而有所差異,但多在pH5.0左右。HRP易溶于水和58%以下的飽和硫酸銨溶液。

HRP酶蛋白和其它雜蛋白的最大吸收光譜為275nm,輔基部分的最大吸收光譜為403nm,二者比值OD403/OD275為酶的純度。以RZ(Reinheit Zabl德文)表示。RZ3為高質(zhì)量,RZ2.5為中等質(zhì)量,RZ2.5則需要純化。RZ值越小,表示雜蛋白越多,RZ0.6,則表示有75%的雜蛋白。

衡量酶質(zhì)量的標準有兩條,一個是純度即RZ值,一個是活力。只用酶的純度表示是不全面的。目前國際上規(guī)定,酶的活力以國際單位表示。一個酶單位是在一定的條件下(pH、溫度和底物濃度)一分鐘能降解1mMol/L底物的酶活力。1mg酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活性。用比活性進行酶的比較。

用作標記的過氧化物酶活性一般要大于250units/mg

4HRP的作用底物與供氫體 底物為H2O2,催化時需供氫體。

組化法常用的供氫體是33-二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(3.3diaminobenzidine . DAB)。其反應(yīng)物由于形成的氧化型中間體迅速聚合,形成不溶性的棕色吩嗪衍生物,可用于光學顯微鏡觀察。這種多聚物能還原和螯合四氧化鋨(OSO4)形成具有電子密度的產(chǎn)物,可適用于電子顯微鏡觀察。

用于ELISA的供氫體有下列數(shù)種。

ELISA的供氫體

反應(yīng)顏色

波長

終止劑

終止

顏色

測定波長

聯(lián)大茴香胺(OD)

桔紅

512

5Mol/L HCI

400

鄰苯二胺(OPD)

444

2Mol/L H2SO4

桔黃

492

鄰苯甲苯胺(OT)

636

2Mol/L H2SO4

442

5-氨基水楊酸

475

1Mol/L NaOH

449

ODOPD最為常用。OPD有致癌作用,使用時需注意。

5.堿性磷酸酶 可從小牛腸粘膜或大腸桿菌中提取。它是一種磷酸脂酶,其作用是催化磷酸-脂水解釋放出無機磷酸而顯色。或者通過水解產(chǎn)生的磷酸與鉬酸反應(yīng)生成磷鉬酸,然后在還原劑作用下生成藍色的產(chǎn)物進行測定。

 

 

 

 
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