交聯(lián)法
交聯(lián)法通常用的交聯(lián)劑是戊二醛,戊二醛商品大多為25%的水溶液,利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基,分別與酶和蛋白質(zhì)分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結(jié)合而進行標記。標記時應盡量采用新鮮純品,當戌二醛的OD235nm/OD280nm<3時,即為好的交聯(lián)劑。
戊二醛交聯(lián)法又分為一步法和二步法。
⑴ 一步法:即把酶、戊二醛和抗體一起加入進行交聯(lián)。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結(jié)合物。由于抗體分子量大(16萬),酶分子量小(4萬),抗體分子的氨基數(shù)比酶蛋白分子氨基數(shù)多得多,結(jié)果生成的抗體-戊二醛或抗體-戊二醛-抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作:①抗IgG-AKP的制備:將10mgAKP溶于含有5mg抗IgG的1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0)中,在冰浴中緩緩攪拌,盡量避免氣泡產(chǎn)生,完全溶解后,緩緩滴加1%戊二醛溶液4ml,使戊二醛的最終濃度為0.2%,移至室溫中靜置2h~3h后,以0.01Mol/L pH7.0 PBS液
⑵ 二步法:是先使酶與戊二醛反應,除去未反應的戊二醛,再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結(jié)合,最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作:將10mg的酶溶于0.2ml含1.25%戊二醛的0.1mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18h,充分透析或以SephadexG25柱除去未反應的戊二醛。加生理鹽水至1ml然后加入1ml(含5mg)的抗體溶液和1ml 1Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液,混合后
改良HRP二步標記法:取HRP10mg溶于0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS液中或0.05Mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液中,加入25%戊二醛0.1ml,
氧化法
采用過碘酸鈉,過碘酸鈉是強氧化劑,能將HRP的甘露糖部分(與酶活性無關的部分)的羥基氧化成醛基,然后與抗體的氨基結(jié)合,形成酶標抗體。
(1)氧化法操作過程如下:將5mgHRP溶于新配制的1ml 0.30Mol/LpH8.1重碳酸鈉中,加0.1 ml 1%氟二硝基苯(FDNB)無水乙醇溶液,在室溫中混合后,再加入1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L過碘酸鈉(NaIO4),置室溫中輕攪30min,在溶液呈黃綠色時,加1ml 0.16Mol/L乙二醇溶液,在室溫中放置1h,使氧化反應中止,然后在
(2)改良過碘酸鈉法:①取5mg HRP溶于0.5ml雙餾水中,加入新配制的0.06Mol/L NaIO4水溶液(10ml雙餾水+128mg NaIO4) 0.5ml,混勻,置
戊二醛法與過碘酸鈉法比較
比較項目 |
戊二醛法 |
過碘酸鈉法 |
|
一步法 |
二步法 |
||
標記方法 |
簡單 |
較復雜 |
較復雜 |
酶利用率 |
2~4% |
2~4% |
70%酶偶聯(lián)到99%抗體上 |
產(chǎn)率 |
<5% |
<5% |
>50% |
標記抗體分子量 |
750萬 |
<25萬 |
>40萬 |
穿入組織能力 |
差 |
好 |
一般 |
抗體活性丟失 |
多 |
少 |
較多 |
酶活性丟失 |
多 |
少 |
較多 |
染色效應 |
差 |
較好 |
較好 |
二馬來酰亞胺法
二馬來酰亞胺(Dimaleimide)能與蛋白質(zhì)半胱氨酸的硫基反應。首先用α-巰基乙胺還原蛋白質(zhì)(IgG),并用N、N‘-O-苯二馬來酰亞胺活化,然后除去多余的試劑,最后使含二馬來酰IgG與含硫基的β-半乳糖苷酶連接。具體操作如下:將抗lgG抗體溶于0.1Mol/L pH5.0醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜,離心除去不溶性物質(zhì),抗IgG(14mg/2ml)與10mlα-巰基乙胺在