材料與方法
1.抗原動(dòng)物及免疫方法 抗原為哈爾濱獸醫(yī)研究所保存的馬傳貧病毒株培養(yǎng)物制備的可溶性抗原。免疫動(dòng)物為6~8周齡的Balb/c鼠。初次免疫用含完全佐劑抗原0.2ml(病毒含量為1.0×108/ml制備的可溶性抗原)腹腔接種,經(jīng)2周再次免疫接種,應(yīng)用不完全佐劑抗原0.2ml腹腔接種,再經(jīng)3周強(qiáng)化免疫,接種可溶性抗原0.3ml,3天后取脾臟。
2.細(xì)胞培養(yǎng) SP2/0鼠骨髓瘤胞株,培養(yǎng)液為含0.025Mol/L HEPES的RPMI-1640(pH7.3),另加新生牛血清15%NEAA液1%,丙酮酸鈉(1.1%)和谷氨酰胺(2.92%)各1%,青鏈霉素(100U或µg/ml)1%,39℃CO2培養(yǎng)箱中孵育,CO2濃度為5%。
3.細(xì)胞融合及克隆化 取SP2/0鼠骨髓瘤細(xì)胞1.0×107/ml和脾細(xì)胞2.0×107個(gè)/ml,離心沉淀?xiàng)壣锨,然后向?xì)胞沉淀中加入細(xì)胞融合劑0.7ml(50%PEG 4 000),按常規(guī)細(xì)胞融合程序進(jìn)行。用HAT完全培養(yǎng)基做稀釋?zhuān)囵B(yǎng)在事先加有飼養(yǎng)細(xì)胞的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,經(jīng)7天具有雜交瘤細(xì)胞增殖,形成有數(shù)十個(gè)細(xì)胞菌落。當(dāng)對(duì)其培養(yǎng)上清液檢查抗體為陽(yáng)性時(shí),以96孔培養(yǎng)板有限稀釋法和鋼杯法將細(xì)胞做克隆化培養(yǎng)和增殖,然后轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。
4.抗體檢測(cè)及鑒定
(1) ELISA法:HRP標(biāo)記兔抗鼠Balb/c結(jié)合物(北京生物制品研究所購(gòu)買(mǎi)),用MR580微量ELISA自動(dòng)讀數(shù)儀判讀結(jié)果。
(2) IF法:直接法用兔抗鼠Balb/c IgG熒光抗體診斷血清對(duì)雜交瘤細(xì)胞染色,對(duì)照用SP2/0細(xì)胞,間接法用感染馬傳貧病毒的驢胎皮膚細(xì)胞及其正常驢胎皮膚細(xì)胞分別載于涂片上丙酮固定后,加A4、A5及C4培養(yǎng)物上清液,置37℃30min,然后用PBS洗滌三次,再用兔抗鼠Balb/c IgG熒光抗體診斷血清,置37℃30min,PBS洗滌3次,熒光顯微鏡下觀(guān)察,并用SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)物上清做陰性對(duì)照。鏡下細(xì)胞呈綠色熒光者判為陽(yáng)性。
(3) 瓊脂免疫雙擴(kuò)散法
(4) SDS—PAGE法
(5) McAb的純化,以雜交瘤細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)液和腹水做SPA-Sepbarosecl-4B親和層析。
(6) 雜交瘤細(xì)胞染色體的檢測(cè)
(7) 中和試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)
結(jié)果
1.雜交瘤細(xì)胞的篩選 融合后的細(xì)胞接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,第7天融合細(xì)胞開(kāi)始增殖,經(jīng)ELISA和IF篩選,獲得A4、A5及C4三個(gè)分泌馬傳貧病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。
2.馬傳貧雜交瘤細(xì)胞的染色體組型分析 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)為72,Balb/c鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40,雜交瘤細(xì)胞系A(chǔ)4為97.80±3.87;A5為 100.93±5.50;C4為98.10±4.47。
3.馬傳貧雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的動(dòng)力學(xué) 對(duì)A 4、A5 和C4三株雜交瘤細(xì)胞1~60代培養(yǎng)上清液進(jìn)行了ELISA檢測(cè),A4、A5兩株抗體分泌較為穩(wěn)定,C4株的抗體分泌有逐漸減少的趨勢(shì)。
4.馬傳貧雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的特異性 以A 4、A5 和C4雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液分別給Balb/c鼠腹腔接種后引起的腹水及該鼠的抗血清同馬傳貧病毒(遼系毒和黑系毒)。能感染馬匹的乙腦病毒和同為逆轉(zhuǎn)錄病毒科的牛白血病病毒抗原進(jìn)行ID、CF及ELISA檢測(cè),僅見(jiàn)同馬傳貧抗原呈陽(yáng)性反應(yīng),其余皆陰性。