原理

等電聚焦技術(shù)是一種根據(jù)樣品的等電點(diǎn)不同而使它們在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)。

本法的分辯率極高，所以在進(jìn)行等電聚焦電泳時，要求樣品不能過于復(fù)雜，一般應(yīng)經(jīng)其他方法（如層析法）提純后再進(jìn)行等點(diǎn)聚焦，才能得到比較滿意的結(jié)果。如利用人的純IgG再經(jīng)過等電聚焦電泳，可以滿意地分離IgG的四個亞類。如IgG₂濃縮于pH7.0的部位，IgG₃濃縮于pH8.0~9.0的范圍內(nèi)，IgG₄則濃縮于pH6.0以下的部位，而IgG則分布于全部pH范圍，且只有IgG₁能存在于pH9.0以上的部位。

等電聚焦電泳與其他分離方法結(jié)合起來，將是一項很有前途的分析鑒定和制備樣品的好技術(shù)。

器材與試劑配制

1．聚焦柱 有成品出售，分110ml和440ml兩種。

2．電源 0V~1 200V可調(diào)20W的直流穩(wěn)壓電源。

3．載體兩極電解質(zhì) 市售25ml瓶裝，濃度為40％或20％（W/V），pH范圍為2.5~11，也有其它pH范圍的，可根據(jù)實(shí)驗條件選擇購買。

4．蔗糖（分析純）

1． 電極液的配制見表：

表 電極緩沖液的配制

表 負(fù)極緩沖液的配制

此配制用量為最大用量，一般用1/5的量即可。括號內(nèi)為440ml聚焦柱型號所用量配方。

6．重、輕液的配制與混合

⑴重、輕液的配制：配制方法見表：

表 重、輕液的配制方法

此表為梯度混合器所用量，如用手工混合法則應(yīng)相應(yīng)適當(dāng)增加20％。

⑵重、輕液的混合：有條件的可采用梯度混合器裝柱。手工混合法操作如下：取24支試管（440ml聚焦柱則應(yīng)取46支試管）按2-5表各加入重、輕液，充分混勻。

表 重、輕液的混合方法

操作方法

1．決定電極的極性 如pH梯度范圍在6以下時，則聚焦柱底的電極為正極。如pH梯度的范圍在6以上時，則柱底為負(fù)極。原因是蔗糖濃度越大，電導(dǎo)越小，所以在等電點(diǎn)pH6～7的載體處，應(yīng)該避免蔗糖濃度最大的部位。

2．裝柱 按電極的極性與電極液的要求裝柱。將聚焦柱垂直放置，先注入底部電極液，打開中心管下端的活塞，從中心管上端，用帶長膠管的注射器注入電極液，使液面在中心管下部開口處之上達(dá)1cm處即可。

3．注入載體溶液 加完后應(yīng)使電極液仍浸沒中心管的下部開口，不使電極與載體溶液直接接觸。

4．加重、輕混合液 從1號試管加起，用注射器沿管壁緩緩加入，流速約3ml/min，全部重、輕混合液加完后，再在上部加電極液，使上部電極浸沒。

5．連接冷凝水管。

6．電泳 電壓300V。開始電泳時，由于載體分子都不處于等電狀態(tài)，所以它們都帶電，在電場影響下向各自的等電點(diǎn)移動，因此開始時電流較大，以后逐漸減小。所以在開始時電壓可稍低一些。電泳結(jié)束時電流約為0.30mA，電泳時間2～3天。

7．樣品的收集 斷電后，關(guān)閉中心管下端活塞以免電極液流出，放入樣品，流速2ml/min為宜。以部分收集器收集，每管2ml。

8．測每管的pH值和蛋白含量，將相近pH的同一蛋白質(zhì)的管合并。

9．將分離的每一樣品成分過SepHadexG25（或G50），將蛋白質(zhì)與載體分離開來。