原理

圓盤電泳即聚丙烯酰胺凝膠電泳。它是利用丙烯酰胺和雙丙烯酰胺在催化劑的作用下聚合成大分子的凝膠物。它同時兼有分子篩和電泳效應(yīng)。當(dāng)樣品通過凝膠進(jìn)行電泳時，便可以根據(jù)其樣品中各分子的電荷和分子量的不同而泳動出不同的區(qū)帶。由于聚丙烯酰胺凝膠化學(xué)性質(zhì)較瓊脂穩(wěn)定，很少帶有側(cè)基，在電泳過程中，吸附作用與電滲作用均小，所以該技術(shù)的分辨率均高于其它瓊脂電泳技術(shù)。

材料與試劑

1．20％單體母液

丙烯酰胺（Aorylamide） 19.60g

雙丙烯酰胺（N，N—methylene Bisaerylamide） 0.40g

H2O 加至 100.00ml

2．pH8.0 Tris—EDTA緩沖液

Tris（三羥基甲基氨基甲烷） 6.05g

EDTA（乙二胺四乙酸） 1.17g

H2O 加至 100.00ml

3．B—三甲基胺基丙腈液（B—DMPN）

（Dimethylaminopropionitrile），原液于4℃冰箱保存。

4．10％過硫酸銨溶液

過硫酸銨 0.50g

H2O 加至 5.00ml

現(xiàn)用現(xiàn)配或配后低溫保存不超過一周。

5．0.025Mol/L pH9.0 硼酸緩沖液

硼酸 3.948g

硼砂 30.512g

H2O 加至 1000.0ml

使用時取該液90ml加H2O至1 440ml，即為電泳液。

操作方法

1．凝膠管的制備 取20％單體母液3.60ml，Tris－EDTA緩沖液1.20ml，加蒸餾水7ml，混勻，再加入B－DMPN液0.05ml（約2滴），10％過硫酸銨溶液0.15ml（約5滴~6滴），混勻，倒入一端用橡皮薄膜封閉的小膠管內(nèi)（注意不要產(chǎn)生氣泡），上端留1ml空處，加蒸餾水至滿，在燈光照耀下30min，使之聚合成凝膠。

2．樣品處理 取待測樣品與對照樣品各0.10ml，分別加0.5％溴麝香酚蘭指示劑一小滴，再加25％蔗糖液0.10ml（約3小滴）。混合即可。

3．加樣 用毛細(xì)吸管吸棄膠管上的蒸餾水，緩緩加入已處理的樣品于凝膠柱上，每種樣品加一管，管的上端留出約0.50cm的空處。

4．電泳 除去凝膠管下端的橡皮薄膜，將膠管裝入電泳槽內(nèi)，加入pH9.0的0.025mol/L硼酸緩沖液，液體必須沒過膠管的兩端。下端接正極，上端接負(fù)極，進(jìn)行電泳。開始以1mA/管的電流，以后可以逐漸加至4mA/管，待指示劑電泳到離膠管下口約0.5cm時（一般約需40min），停止電泳。

5．剝膠 取出膠管，用帶有注射器的長針頭插入膠管壁與凝膠柱之間注入蒸餾水以使凝膠脫出。

6．染色 將剝出的凝膠柱浸泡于0.05％氨基黑10B溶液中10min~20min，用水沖洗，然后用7％的冰醋酸液脫色24h，中間換液數(shù)次，至背景無色為止，最后浸泡于7％的冰醋酸溶液中保存。

結(jié)果判定

與標(biāo)準(zhǔn)品比較，根據(jù)區(qū)帶的位置進(jìn)行定性檢查。

注意事項

1．樣品的離子強度、pH值盡可能與濃縮膠溶液相同，如含大量鹽類時，應(yīng)透析除鹽。最適合的樣品蛋白量是10μg～100μg，加入樣品量要少，血清樣品3μl～5μl，免疫球蛋白樣品可加15μl～20μl。

2．凝膠柱面應(yīng)平整，操作過程切勿產(chǎn)生氣泡，否則電泳區(qū)帶不整齊。

3．電泳中電流應(yīng)保持穩(wěn)定，避免電流強度過高，而產(chǎn)生大量的熱使分離失敗。

4．電泳開始，樣品應(yīng)于5min～10min內(nèi)進(jìn)入凝膠柱內(nèi)為佳。

5．藥品大部分有毒，應(yīng)注意防護(hù)。