間接紅血球凝集反應(yīng)（簡稱間接血凝）是間接凝集反應(yīng)中應(yīng)用最廣的一種方法。
原理
以紅血球為載體的間接凝集反應(yīng)叫做間接血凝。將抗原吸附在紅血球上用以檢測微量抗體稱為正向間接血凝，以抗體吸附于紅血球上，檢測相應(yīng)的抗原，稱為反向間接血凝。
用抗原吸附紅血球，一般比較容易，但用免疫血清吸附紅血球，則困難得多，而且往往不易獲得良好的結(jié)果，因為免疫血清中的成分非常復(fù)雜。許多其他蛋白質(zhì)和非抗體活性的免疫球蛋白占據(jù)紅血球的表面，而影響血球的特異性凝集。
材料與試劑
1．紅血球
2．反應(yīng)板 分聚苯乙烯塑料板和有機玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有96孔和72孔兩種規(guī)格。按孔型又可分為V和U型兩種，V型具有更典型的凝集模型，U型有時比V型的血清效價高1～2孔。反應(yīng)板不能煮沸消毒和浸泡于來蘇兒水中。消毒可用0.5％甲醛溶液，1％新潔爾滅及紫外線照射等。
3．稀釋棒 由合金制成。棒頭有8條溝，吸液量為0.025ml，通過火焰，使表面氧化變粗易于吸取液體。它的作用是蘸取、轉(zhuǎn)移、混合液體。為了長期保持棒頭的氧化層，每使用20次左右，應(yīng)過火焰一次。
4．標準滴管 每滴0.025ml。
5．微型振蕩器
6．兔血清鹽水 作為穩(wěn)定劑，用于懸浮致敏紅血球以及稀釋供試血清。制法為：無菌采取兔血，收集血清，滅活后
7．抗原 盡可能使用高純度的抗原。
8．供試血清或其它含抗體材料 供試血清必須滅活，加9倍2.5％的紅血球懸液，
9．醛化劑 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。
10．優(yōu)質(zhì)鞣酸
11．0.15Mol/L pH6.4PBS液，用于紅血球致敏。
12．0.15Mol/L pH7.2PBS液，用于一般稀釋液。
13．0.02％牛血清白蛋白PBS液
14．生理鹽水
紅血球的處理
1．新鮮紅血球 新鮮紅血球用阿氏液保存于
2．紅血球醛化極其優(yōu)點
（1）醛化方法：常見的醛化劑有甲醛、戊二醛和丙酮醛。
甲醛醛化過程：①將紅血球用pH7.2PBS反復(fù)洗滌4次，以除去血清蛋白以及紅血球表面的膠體物質(zhì)；②按1︰8的比例取紅血球（壓積）和3％甲醛液（用pH7.2PBS稀釋，預(yù)先冷卻至
戊二醛醛化過程：①取新鮮紅血球，以生理鹽水洗滌4次；②以0.15Mol/L pH 7.2 PBS配成1％戊二醛溶液，
丙酮醛—甲醛雙醛化過程：①取新鮮紅血球，洗滌4次，配成8％的懸液；②于紅血球懸液中加等量的3％丙酮醛室溫電磁攪拌16h～18h；③洗滌5次，再配成8％的懸液；④于紅血球懸液中加等量的3％甲醛，電磁攪拌16h～18h；⑤洗滌5次，最后以pH 7.2 PBS配成10％的懸液，加1／萬硫柳汞防腐，
（3）醛化紅血球的優(yōu)點：①性質(zhì)穩(wěn)定，不影響紅血球表面的吸附能力；②重復(fù)性好，易標準化。③可較長期保存，醛化后
（4）影響醛化的因素：①紅血球的潔凈程度：由于紅血球表面殘留血漿蛋白和其它膠質(zhì)，易引起自家凝集，所以一定要充分洗凈；②紅血球的濃度：醛化時應(yīng)盡量使紅血球稀釋度低一些，以減少紅血球的凝集和變形；③醛化時的溫度與醛化紅血球的質(zhì)量有很大關(guān)系，一般認為最好是
表 各種雙醛化紅細胞的結(jié)果比較
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雙 醛 化 |
上海第六 人民醫(yī)院 |
首都 醫(yī)院 |
國外 資料 |
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抗原滴度 |
抗原滴度 |
脈沖／min |
抗原滴度 |
脈沖／min |
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丙酮醛＋甲醛 戊二醛＋丙酮醛 丙酮醛＋戊二醛 |
217 219 215 |
211 － － |
5107～5118 － － |
2×106 6×106 6×106 |
1684 2154 3750 |
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脈沖／min是131I標記的特異性抗體結(jié)合到細胞上的指標，脈沖數(shù)越大，結(jié)合抗體量也越多。但是從表5－1中可以看出結(jié)合量同可測出的抗原滴度是不平行的。
適當?shù)恼袷幙墒谷┗瘎┡c紅血球充分接觸，并可排除凝塊形成。但過分地振蕩，則易產(chǎn)生氣泡，引起紅血球變形。
3．紅血球鞣化 多糖、脂多糖、類脂等一些半抗原易于吸附紅血球表面，所以一般醛化處理即可。但對于許多蛋白質(zhì)抗原，由于不易吸附于紅血球表面，所以在醛化的基礎(chǔ)上，必須再以一定濃度的鞣酸進行處理，強化它對蛋白質(zhì)的吸附能力。
有人認為雙醛化后可不必進行鞣化。首都醫(yī)院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多數(shù)意見認為醛化后仍需鞣化比較好。
(1) 鞣化過程：①將10％醛化紅血球用生理鹽水洗滌2次，再以0.15Mol/L pH7.2PBS洗滌1次，最后以PBS配成2.50％懸液；②稱取優(yōu)質(zhì)鞣酸20mg，以生理鹽水4ml配成1﹕200的濃度，于
（2）影響鞣化的因素：①鞣酸的質(zhì)量：這是很重要的，所以必須采用優(yōu)質(zhì)鞣酸。分析純的鞣酸呈面包屑狀，不呈面粉狀，有折光性；②鞣酸的濃度：濃度過高，可以出現(xiàn)紅血球的凝集現(xiàn)象；濃度過低，達不到紅血球的活化作用。醛化過的紅血球所采用的鞣酸濃度一般比新鮮紅血球高10倍。通常以1：2 000為佳；③鞣化時間：鞣化過程一般10min～15min即可完成。時間再長也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化時采用的pH對吸附抗原和血凝滴度影響不大，一般采用pH7.2的PBS液。
紅血球的致敏
1．致敏抗原劑量的確定 一般而言，在一定的范圍內(nèi)，抗原的濃度與試驗的敏感性呈正比，超過這個范圍，再增加抗原，敏感性不會再提高，而且過大，有時會引起非特異性凝集。當采用一種新的抗原時，必須經(jīng)過試驗，選擇適當?shù)目乖旅魸舛�，即把抗原稀釋成幾個不同的濃度分別致敏紅血球。再用這些致敏紅血球分別與標準陽性血清進行試驗，與標準陽性血清呈最高滴度的陽性反應(yīng)的最小抗原劑量，即為該抗原的單位計量。致敏時，根據(jù)不同的抗原，可采用2～4個單位計量進行致敏。
2．致敏方法 各種抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白質(zhì)的致敏方法如下：
所需濃度的抗原 1 份
pH6.4PBS液 4 份
2.50％的鞣化紅血球懸液 1 份
混勻，置
3．影響紅血球致敏的因素
⑴要有高純度或高效價的抗原或抗體。
⑵被致敏抗原或抗體的適當劑量和濃度。如抗體一般以μg/ml IgG為宜�？关i瘟IgG一般用80μg/ml～160μg/ml，抗口蹄疫IgG 20μg/ml~40μg/ml，抗豬水泡病IgG 130μg/ml~160μg/ml，抗豬肺疫IgG 30μg/ml ~40μg/ml，抗豬弓形體20μg/ml~40μg/ml，抗原一般用0.2mg/ml～1mg/ml。
⑶pH：除雞卵蛋白采用4.6～5.1外，其它通常采用5.6～6.4，高于7.2或低于4.6均可使紅血球發(fā)生自凝。
⑷致敏溫度：一般為
⑸致敏時間：一般采用30min為最適時間，具有良好的特異性和重復(fù)性。也有采用60min。時間過長，會造成紅血球的形態(tài)不整，反應(yīng)結(jié)果紊亂等。
⑹血球濃度：一般為1％，范圍為0.5％～1.5％。
操作方法
可采用試管法、凹窩板法和微量法。前者稀釋度準確、結(jié)果清晰、終點明確。后者具有節(jié)約材料、操作方便、結(jié)果出現(xiàn)迅速等優(yōu)點。
試管法的供試材料用兔血清鹽水二倍遞減稀釋，每管0.50ml，各管加致敏血球0.05ml，充分振蕩，混勻后置室溫，紅血球完全沉下（需數(shù)小時）或過夜后判定結(jié)果。
每次試驗需做下列對照：①血清對照：最高濃度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球?qū)φ眨和醚妍}水＋鞣酸血球；③致敏血球?qū)φ眨和醚妍}水＋致敏血球；④標準陽性血清對照：稀釋已知滴度的陽性血清，加致敏血球以檢驗試驗的敏感性是否前后一致。
結(jié)果判定
＋＋＋＋：管底呈細密的顆粒凝集，邊緣不整齊。
＋＋＋ ：全管底呈光滑的均勻片層，邊緣折疊。
＋＋ ：全管底呈光滑的均勻片層，如傘狀。
＋ ：管底大部分復(fù)以光滑片層，邊緣稍厚。
± ：較“＋”面積更小，中央有沉積的紅血球。
— ：紅血球沉積在管底中央，如小圓盤或鈕扣狀。
以“＋＋”為滴度終點。