按細胞比重分離B細胞

1．將2～3ml含3×107純化的B細胞（B細胞>90％）的細胞懸液加到3ml Percoll溶液（比重1.074）上，水平離心1000×g 20分鐘。

2．吸去無細胞上清液，交界面的低密度B細胞和大部分Percoll溶液。由于此時細胞沉淀非常松散，需留下約0.2ml Percoll溶液以防吸去了沉淀細胞。輕敲離心管，用留下的液體懸浮高密度B細胞。

3．用洗滌液分別洗滌低密度B細胞和高密度B細胞兩次，每次離心500×g 10分鐘。最后，測定細胞數(shù)和細胞活力，用1～2ml含5％小牛血清的洗滌液將細胞配成適當濃度。

用尼龍毛法分離B細胞

1）尼龍毛柱的制備

1．取直接3D，長度約10cm的尼龍毛，用0.2mol/L HCl浸泡處理過夜。用雙蒸水洗凈HCl，置37℃烘干備用。

2．稱取50mg尼龍毛，均勻分散，置Hanks液中浸泡。取1ml注射器，出口接塑料管并夾住。將尼龍毛均勻填塞入注射器中，排凈空氣，柱高約5～6cm。此柱可分離約2×107細胞。將柱置－20℃可保存2～3個月。

2）分離細胞

1．取分離的單個核細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞配成2×107/0.5ml。

2．融化尼龍毛柱，以每分鐘5～7滴的速度放出Hanks液，并用5ml預(yù)溫至37℃的細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱。小心將細胞懸液加入尼龍毛柱中，待細胞懸液全部進入尼龍毛柱后，立即加0.2ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管。

3．在37℃ 5％ CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置1小時。用5ml預(yù)溫至37℃的細胞培養(yǎng)液洗脫細胞。洗脫液中含有純的T細胞。再用5ml預(yù)溫至37℃的細胞培養(yǎng)液洗滌尼龍毛柱，洗凈不粘附的細胞。

4．加入0.5ml細胞培養(yǎng)液，夾住塑料管，將尼龍毛柱置冰箱中冷卻。用4℃預(yù)冷的細胞培養(yǎng)液分3～4次洗脫尼龍毛柱，每次0.5ml。可先夾住塑料管，用玻璃棒或金屬絲反復(fù)擠壓尼龍毛以利粘附細胞脫落，然后再洗脫。洗脫液中含有大量B細胞。離心1000×g 10分鐘，去上清液，用細胞培養(yǎng)液同樣洗滌細胞1次。計數(shù)細胞，用細胞培養(yǎng)液將細胞配成適當濃度。