一、從小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分離巨噬細(xì)胞
1.取6周左右的小鼠(或600克左右的豚鼠,或3公斤左右的家兔),剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射1ml(豚鼠20ml,家兔200ml)無(wú)菌的液體石蠟或巰基乙酸肉湯或4%淀粉肉湯。3~4天以后收集腹腔細(xì)胞。
2.如要收集腹腔靜置巨噬細(xì)胞,不注射刺激物,直接從這一步開(kāi)始。放血處死動(dòng)物,以減少腹腔中的紅細(xì)胞。消毒腹部,沿腹中線注入3~4ml(豚鼠20~40ml,家兔50~70ml)冰中預(yù)冷的無(wú)菌PBS-H(含10U/ml肝素和10%小牛血清的PBS)。輕輕按摩腹部5分鐘。
3.以下均無(wú)菌操作。剪開(kāi)腹壁,用吸管吸出滲出液,再用同樣容量的預(yù)冷PBS-H沖洗腹腔2~3次。合并滲出液于離心管中,4℃離心250×g 10分鐘,去上清液。
4.用預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次,每次4℃離心250×g 10分鐘,去上清液。用預(yù)冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞,臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)細(xì)胞并決定細(xì)胞活力。
二、家兔肺泡巨噬細(xì)胞的分離和純化
1.取2~3公斤重的家兔,耳緣靜脈注射10ml空氣處死動(dòng)物或注射2ml(含130mg)戊巴比妥麻醉動(dòng)物。仰臥固定,消毒胸部,剪開(kāi)胸壁。以下過(guò)程注意無(wú)菌操作。小心從環(huán)狀軟骨下方剪下氣管,分離心臟和血管,取出肺,剪去脂肪和結(jié)締組織。用無(wú)菌紗布小心擦凈肺表面,稱重。
2.分離肺泡巨噬細(xì)胞:用夾子夾住氣管,使肺懸空。向氣管中注射40ml無(wú)菌的冷生理鹽水,讓生理鹽水進(jìn)入全部肺泡。用鑷子提起氣管,從夾子下面剪斷氣管,將肺中的液體倒入離心管中。再用同樣方法,用40ml無(wú)菌冷生理鹽水沖洗肺泡,合并浸出液,置4℃。
3.分離肺組織中的巨噬細(xì)胞:取出肺泡巨噬細(xì)胞后,剪去氣管,將肺組織放在有冷RPMI-1640培養(yǎng)液的平皿中。平皿置冰上,用吸滿冷RPMI-1640培養(yǎng)液的20ml注射器接23號(hào)針頭,一邊灌注一邊用針頭梳離肺組織,直到肺組織與支氣管樹(shù)全部分離。使肺組織通過(guò)00目的鋼絲網(wǎng),分離單個(gè)細(xì)胞。
4.以下過(guò)程均在4℃中進(jìn)行。分別處理肺泡巨噬細(xì)胞和肺組織中的巨噬細(xì)胞:離心200×g 10分鐘,去上清液。輕彈試管,懸浮細(xì)胞,加入10ml低滲液(20mmol/L Tris, 0.75%氯化銨,pH7.4),37℃處理3~5分鐘,溶解紅細(xì)胞。紅細(xì)胞通常分別占肺泡巨噬細(xì)胞和組織巨噬細(xì)胞的1%和10%。也可以不用低滲處理,直接在淋巴細(xì)胞分離液上分離巨噬細(xì)胞。
5.離心200×g 10分鐘,去上清液。用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞一次。將細(xì)胞懸液加在淋巴細(xì)胞分離液(比重1.077)上,離心400×g 20分鐘,收集交界面的巨噬細(xì)胞。棄去沉淀的死細(xì)胞和紅細(xì)胞。
6.用RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌巨噬細(xì)胞2次。臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞數(shù),將細(xì)胞配成所需濃度。此時(shí)巨噬細(xì)胞活力可達(dá)90%以上,巨噬細(xì)胞占全部細(xì)胞的90%以上。
三、從小鼠脾臟、胸腺和骨髓中分離巨噬細(xì)胞
1.用外科方法無(wú)菌摘取小鼠脾臟和胸腺,置于盛有預(yù)冷RPMI-1640培養(yǎng)液(含1%小牛血清)的平皿中,剪去結(jié)締組織和脂肪。用無(wú)菌注射器芯將脾臟或胸腺擠壓通過(guò)200目的鋼絲網(wǎng),獲得單個(gè)細(xì)胞。
2.離心200×g 10分鐘,去上清液。用含1%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將細(xì)胞配成約1×108~5×108/ml。