抗原提純與動物免疫

　　對抗原的要求是純度越高越好，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取1×107個細(xì)胞作腹腔免疫。可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動物免疫。

　　選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠齡在8～12周，雌雄不限。為避免小鼠反應(yīng)而不佳或免疫過程中死亡，可同時免疫3～4只小鼠。

免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價抗體為最終目的。免疫間隔一般2～3周。一般被免疫動物的血清抗體效價越高，融合后細(xì)胞產(chǎn)生高效價特異抗體的可能性越大，而且單克隆抗體的質(zhì)量（如抗體的濃度和親和力）也與免疫過程中小鼠血清抗體的效價和親和力密切相關(guān)。末次免疫后3～4天，分離脾細(xì)胞融合。

　　骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

　　選擇瘤細(xì)胞株的最重要的一點是與待融合的B細(xì)胞同源。如待融合的是脾細(xì)胞，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是Sp2/0細(xì)胞株。該細(xì)胞株生長及融合效率均佳，此外，該細(xì)胞株本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈。細(xì)胞的最高生長刻度為9×105/ml，倍增時間通常為10～15h。融合細(xì)胞應(yīng)選擇處于對數(shù)生長期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞（活性應(yīng)大于95％）。骨髓瘤細(xì)胞株在融合前應(yīng)先用含8-氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為2105/ml，次日一般即為對數(shù)生長期細(xì)胞。

　　在體外培養(yǎng)條件下，細(xì)胞的生長依賴適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度，因而，在培養(yǎng)融合細(xì)胞或細(xì)胞克隆化培養(yǎng)時，還需加入其他飼養(yǎng)細(xì)胞（feedercell）。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞，其中在巨噬細(xì)胞和其他細(xì)胞。亦有用小鼠的脾細(xì)胞、大鼠或豚鼠的腹腔細(xì)胞作為飼養(yǎng)細(xì)胞的。

在制備飼養(yǎng)細(xì)胞時，切忌針頭刺破動物的消化器官，否則所獲細(xì)胞會有嚴(yán)重污染。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至1×105/ml，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng)。

　　細(xì)胞融合

細(xì)胞融合是雜交瘤技術(shù)的中心環(huán)節(jié)，基本步驟是將兩種細(xì)胞混合后加入PEG使細(xì)胞彼此融合。其后吧培養(yǎng)液稀釋PEG，消除PEG的作用。將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng)。融合過程中有幾個問題應(yīng)特別注意。①細(xì)胞比例：骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞的比值可從1:2到1:10不等，常用1:4的比例。應(yīng)保證兩種細(xì)胞在融合前都具有較高活性。②反應(yīng)時間：在兩種細(xì)胞的混合細(xì)胞懸液中，第1min滴加4.5ml培養(yǎng)液；間隔2min滴加5ml培養(yǎng)液，爾后加培養(yǎng)液50ml。③培養(yǎng)液的成分：對融合細(xì)胞，良好的培養(yǎng)液尤其重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制。如融合效率降低，應(yīng)隨時核查培養(yǎng)基情況。

　　有限稀釋法

篩選陽性株一般選用的骨髓瘤細(xì)胞為HAT敏感細(xì)胞株，所以只有融合的細(xì)胞才能待續(xù)存活一周以上。融合細(xì)胞呈克隆生長，經(jīng)有限稀釋后（一般稀釋至0.8個細(xì)胞/孔），按Poisson法計算，應(yīng)有36％的孔為1個細(xì)胞/孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋0％～20％孔底時，吸取培養(yǎng)上清用ELISA檢測抗體含量。首先依抗體的分泌情況篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化，爾后進行抗原特異的ELISA測定，選高分泌特異性細(xì)胞株擴大培養(yǎng)或凍存。

　　單克隆抗體的制備和凍存

　　篩選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早進行抗體制備，因為融合細(xì)胞隨培養(yǎng)時間延長，發(fā)生污染、染包體丟失和細(xì)胞死亡的機率增加。抗體制備有兩種方法。一是增量培養(yǎng)法，即將雜交瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)，在培養(yǎng)液中分離單克隆抗體。該法需用特殊的儀器設(shè)備，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，以利于單克隆抗體的濃縮和純化。最普遍采用的是小鼠腹腔接種法。選用BALB/c小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中去。通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，每只小鼠可收集5～10ml的腹水，有時甚至超過40ml。該法制備的腹水抗體含量高，每毫升可達數(shù)毫克甚至數(shù)十毫克水平。此外，腹水中的雜蛋白也較少，便于抗體的純化。接種細(xì)胞的數(shù)量應(yīng)適當(dāng)，一般為5×105/鼠，可根據(jù)腹水生長情況適當(dāng)增減。

選出的陽性細(xì)胞株應(yīng)及早凍存。凍存的溫度越低越好，凍存于液氮的細(xì)胞株活性僅有輕微的降低，而凍存在－70℃冰箱則活性改變較快。細(xì)胞不同于菌種，凍存過程中需格外小心。二甲亞砜（DMSO）是普遍應(yīng)用的凍存保護劑。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后的活性多在50％～95％之間。如果低于50％，則說明凍存復(fù)蘇過程有問題。

　　單克隆抗體的純化

　　單克隆抗體的純化方法同多克隆抗體的純化，腹水特異性抗體的濃度較抗血清中的多克隆抗體高，純化效果好。按所要求的純度不同采用相應(yīng)的純化方法。一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達到純化目的，也有采用較簡單的酸沉淀方法。目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，多用葡萄球菌A蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體（最常用Sepharose）交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達90％以上。蛋白可與IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3結(jié)合，同時還結(jié)合少量的IgM。洗脫液中的抗體濃度可用紫外光吸收法粗測，小鼠IgG單克隆抗體溶液在A280nm時，1.44（吸光單位）相當(dāng)于1mg/ml。經(jīng)低pH洗脫后在收集管內(nèi)預(yù)置中和液或速加中和液對保持純化抗體的活性至關(guān)重要。

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單克隆技術(shù)鏈接:

The production of monoclonal antibody by hybridoma fusion
Making Monoclonal Antibodies
Fusion and Cloning
Monoclonal Antibody Production
Monoclonal Antibody Screening by Direct ELISA
Tips and hints for the storage of antibodies
Cell Fusion
Protocol for Cell Fusion
General Fusion Protocol
Fusion of Mouse, Rat, or Hamster Cell
Immunization Protocol for Monoclonal Antibody Production
Cloning by Limiting Dilution of Hybridoma
Limiting Dilutions
Protein A Purification of Antibody
Protein G Purification of Antibodies
Purification of Antiserum or Ascites by Protein A/G Chromatography
Affinity Purification of Antibodies
Antibody Purification
Antibody Purification
Antibody Purification on Protein G Column
Antibody Purification Protocol
Column Purification of mAB
Coupling Antibodies to Protein A/G
Coupling Peptides to Resin for Affinity Purification
Purification of Anti Peptide Antibody
Purification of mAb (IgG)