一、基本原理
某些物質(zhì)的分子能吸收能量而發(fā)射出熒光，根據(jù)熒光的光譜和熒光強(qiáng)度，對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性或定量的方法，稱為熒光分析法（fluorescence analysis）。
熒光分析法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、需樣量少和方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，它的測(cè)定下限通常比分光光度法低2~4個(gè)數(shù)量級(jí)，在生化分析中的應(yīng)用較廣泛。
在室溫下分子大都處在基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，當(dāng)受到光的照射時(shí)，便吸收與它的特征頻率相一致的光線，其中某些電子由原來的基態(tài)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)中的各個(gè)不同振動(dòng)能級(jí)，這就是在分光光度法中所述的吸光現(xiàn)象。躍遷到較高能級(jí)的分子，很快（約10-8s）因碰撞而以熱的形式損失部分能量，由所處的激發(fā)態(tài)能級(jí)下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，能量的這種轉(zhuǎn)移形式，稱為無輻射躍遷。由第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)下降到基態(tài)的任何振動(dòng)能級(jí)，并以光的形式放出它們所吸收的能量，這種光便稱為熒光。
熒光分析法是測(cè)定物質(zhì)吸收了一定頻率的光以后，物質(zhì)本身所發(fā)射的光的強(qiáng)度。物質(zhì)吸收的光，稱為激發(fā)光；物質(zhì)受激后所發(fā)射的光，稱為發(fā)射光或熒光。如果將激發(fā)光用單色器分光后，連續(xù)測(cè)定相應(yīng)的熒光的強(qiáng)度所得到的曲線，稱為該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜（excitation spectrum）。實(shí)際上熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜就是它的吸收光譜。在激發(fā)光譜中最大吸收處的波長(zhǎng)處，固定波長(zhǎng)和強(qiáng)度，檢測(cè)物質(zhì)所發(fā)射的熒光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度，所得到的曲線稱為該物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜，簡(jiǎn)稱熒光光譜（fluorescence spectrum）。在建立熒光分析法時(shí)，需根據(jù)熒光光譜來選擇適當(dāng)?shù)臏y(cè)定波長(zhǎng)。激發(fā)光譜和熒光光譜是熒光物質(zhì)定性的依據(jù)。
對(duì)于某一熒光物質(zhì)的稀溶液，在一定波長(zhǎng)和一定強(qiáng)度的入射光照射下，當(dāng)液層的厚度不變時(shí)，所發(fā)生的熒光強(qiáng)度和該溶液的濃度成正比，這是熒光定量分析的基礎(chǔ)。
二、熒光儀的主要部件
測(cè)定熒光可用熒光計(jì)和熒光分光光度計(jì)，二者的結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度不同，但其基本結(jié)構(gòu)是相似的。由光源發(fā)出的光，經(jīng)單色器讓特征波長(zhǎng)的激發(fā)光通過，照射到液槽使熒光物質(zhì)發(fā)射出熒光，經(jīng)第二個(gè)單色器讓待測(cè)物質(zhì)所產(chǎn)生的特征波長(zhǎng)熒光通過，照射到檢測(cè)器產(chǎn)生光電流，經(jīng)放大后以指針指示或用記錄儀記錄其信號(hào)。
儀器的主要部件如下：
1．光源：發(fā)射紫外區(qū)和可見區(qū)的激發(fā)光，一般常用的為溴鎢燈和供蒸汽燈，以及氙弧燈。
2．單色器：儀器共有兩個(gè)單色器，作用分別是濾去非特征波長(zhǎng)的激發(fā)光，和濾去非特征波長(zhǎng)熒光的雜散光。
3．液槽：用來盛放待測(cè)溶液。
4．檢測(cè)器：檢測(cè)待測(cè)物質(zhì)所發(fā)射的熒光信號(hào)。
三、熒光分析法的定性和定量
（一）定性分析
熒光物質(zhì)特性的光譜包括激發(fā)光譜和熒光光譜兩種。在分光光度法中，被測(cè)物質(zhì)只有一種特征的吸收光譜，而熒光分析法能測(cè)出兩種特征光譜，因此，鑒定物質(zhì)的可靠性較強(qiáng)。當(dāng)然，必須在標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照下進(jìn)行定性。
（二）定量測(cè)定
熒光分析法的定量測(cè)定方法較多，可分為直接測(cè)定法和間接測(cè)定法兩類。
1、直接測(cè)定法：
利用熒光分析法對(duì)被分析物質(zhì)進(jìn)行濃度測(cè)定，最簡(jiǎn)單的便是直接測(cè)定法。某些物質(zhì)只要本身能發(fā)熒光，只須將含這類物質(zhì)的樣品作適當(dāng)?shù)那疤幚砘蚍蛛x除去干擾物質(zhì)，即可通過測(cè)量它的熒光強(qiáng)度來測(cè)定其濃度。具體方法有兩種。
（1）直接比較法：配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度Fx，已知標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度Cs，便可求得樣品中待測(cè)熒光物質(zhì)的含量。
如果空白溶液的熒光強(qiáng)度調(diào)不到零，則必須從Fs和Fx值中扣除空白溶液的熒光強(qiáng)度F0，然后進(jìn)行計(jì)算。
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線法：將已知含量的標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過和樣品同樣處理后，配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度對(duì)熒光物質(zhì)含量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再測(cè)定樣品溶液的熒光強(qiáng)度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線便可求出樣品中待測(cè)熒光物質(zhì)的含量。
為了使各次所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線能重合一致，每次應(yīng)以同一標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)儀器進(jìn)行校正。如果該溶液在紫外光照射下不夠穩(wěn)定，則必須改用另一種穩(wěn)定而熒光峰相近的標(biāo)準(zhǔn)溶液來進(jìn)行校正。例如，測(cè)定維生素B1時(shí)，可用硫酸奎寧溶液作為基準(zhǔn)；測(cè)定維生素B2時(shí)，可用熒光素鈉溶液作為基準(zhǔn)來校正儀器。
2、間接測(cè)定法：
有許多物質(zhì)，它們本身不能發(fā)熒光，或者熒光量子產(chǎn)率很低，僅能顯現(xiàn)非常微弱的熒光，無法直接測(cè)定，這時(shí)可采用間接測(cè)定方法。
間接測(cè)定方法有以下幾種：
（1）化學(xué)轉(zhuǎn)化法：通過化學(xué)反應(yīng)將非熒光物質(zhì)變?yōu)檫m合于測(cè)定的熒光物質(zhì)。例如金屬與螯合劑反應(yīng)生成具有熒光的螯合物。有機(jī)化合物可通過光化學(xué)反應(yīng)、降解、氧化還原、偶聯(lián)、縮合或酶促反應(yīng)，使它們轉(zhuǎn)化為熒光物質(zhì)。
（2）熒光猝滅法：這種方法是利用本身不發(fā)熒光的被分析物質(zhì)能使某種熒光化合物的熒光猝滅的性質(zhì)，通過測(cè)量熒光化合物熒光強(qiáng)度的下降，間接地測(cè)定該物質(zhì)的濃度。
（3）敏化發(fā)光法：對(duì)于很低濃度的分析物質(zhì)，如果采用一般的熒光測(cè)定方法，其熒光信號(hào)太弱而無法檢測(cè)，可使用一種物質(zhì)（敏化劑）以吸收激發(fā)光，然后將激發(fā)光能傳遞給發(fā)熒光的分析物質(zhì)，從而提高被分析物質(zhì)測(cè)定的靈敏度。
上述三種方法均為相對(duì)測(cè)定方法，在實(shí)驗(yàn)時(shí)須采用某種標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較。
四、減小測(cè)量誤差的方法
（1）溶劑：溶劑能影響熒光效率，改變熒光強(qiáng)度，因此，在測(cè)定時(shí)必須用同一溶劑。
（2）濃度：在較濃的溶液中，熒光強(qiáng)度并不隨溶液濃度呈正比增長(zhǎng)。因此，必須找出與熒光強(qiáng)度呈線性的濃度范圍。
（3）酸度：熒光光譜和熒光效率常與溶液的酸度有關(guān)，因此，須通過條件試驗(yàn)，確定最適宜的pH值范圍。
（4）溫度：熒光強(qiáng)度一般隨溫度降低而提高，因此，有些熒光儀的液槽配有低溫裝置，使熒光強(qiáng)度增大，以提高測(cè)定的靈敏度。在高級(jí)的熒光儀中，液槽四周有冷凝水并附有恒溫裝置，以便使溶液的溫度在測(cè)定過程中盡可能保持恒定。
（5）時(shí)間：有些熒光化合物需要一定時(shí)間才能形成；有些熒光物質(zhì)在激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間照射下會(huì)發(fā)生光分解。因此，過早或過晚測(cè)定熒光強(qiáng)度均會(huì)帶來誤差。必須通過條件試驗(yàn)確定最適宜的測(cè)定時(shí)間，使熒光強(qiáng)度達(dá)到量大且穩(wěn)定。為了避免光分解所引起的誤差，應(yīng)在熒光測(cè)定的短時(shí)間內(nèi)才打開光閘其余時(shí)間均應(yīng)關(guān)閉。
（6）共存干擾物質(zhì) 有些干擾物質(zhì)能與熒光分子作用使熒光強(qiáng)度顯著下降，這種現(xiàn)象稱為熒光的猝滅（quenching）；有些共存物質(zhì)能產(chǎn)生熒光或產(chǎn)生散射光，也會(huì)影響熒光的正確測(cè)量。故應(yīng)設(shè)法除去干擾物，并使用純度較高的溶劑和試劑。