食用菌菌種質(zhì)量的優(yōu)劣,直接影響到栽培的成敗和產(chǎn)量的高低,只有優(yōu)良的菌種,才能獲得優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的食用菌。因此食用菌的制種,是生產(chǎn)中一項(xiàng)極其重要的工藝。
食用菌的菌種按培養(yǎng)階段和來源的不同,可分母種、原種和栽培種三種。從食用菌的孢子分離培養(yǎng)或從組織分離培養(yǎng)、基內(nèi)菌絲分離培養(yǎng)所得到的第一代菌絲體,稱為母種。從母種擴(kuò)大培養(yǎng)的菌絲體,稱為原種。從原種擴(kuò)大培養(yǎng)直接用于生產(chǎn)上播種的菌絲體;稱為栽培種。
一、母種的分離和培養(yǎng)
(一)母種培養(yǎng)基的配制
1.母種培養(yǎng)基的種類 母種是菌種生產(chǎn)的關(guān)鍵,要求純度高,不能混生雜菌,同時(shí)母種的菌絲體較為纖細(xì),分解培養(yǎng)料的能力較弱。因此,母種菌絲體需要培養(yǎng)在營養(yǎng)豐富,易被吸收,表面光滑易于鑒別有無雜菌感染的瓊脂培養(yǎng)基上。適合母種菌絲生長的瓊脂培養(yǎng)基種類很多,常用的有下列幾種:
1、
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馬鈴薯——葡萄糖——瓊脂培養(yǎng)基
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馬鈴薯(去皮)
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200克
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瓊脂
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20克
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葡萄糖(或蔗糖)
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20克
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水
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1000毫升
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2、
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麥芽汁——葡萄糖——瓊脂培養(yǎng)基
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干麥芽
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250克
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瓊脂
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20克
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葡萄糖(或蔗糖)
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10克
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水
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1000毫升
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3、
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胡蘿卜——葡萄糖——瓊脂培養(yǎng)基
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胡蘿卜
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100克
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瓊脂
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20克
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葡萄糖(或蔗糖)
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20克
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水
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1000毫升
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4、
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蘑菇汁——葡萄糖一一瓊脂培養(yǎng)基(適用于蘑菇)
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鮮蘑菇
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250克
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瓊脂
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20克
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葡萄糖(或蔗糖)
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20克
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水
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1000毫升
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5、
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蛋白胨——葡萄糖——瓊脂培養(yǎng)基
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蛋白胨
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2克
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葡萄糖
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20克
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磷酸氫二鉀
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2克
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維生素B1(硫胺素)
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0.5毫克
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磷酸二氫鉀
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0.5克
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瓊脂
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18克
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硫酸鎂
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0.5克
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水
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l000毫升
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2.母種培養(yǎng)基的制法 茲以最常用的馬鈴薯——葡萄糖——瓊脂培養(yǎng)基的制法為例介紹如下:先將馬鈴薯去皮,洗滌,切成小塊,加水1000毫升,煮沸15~20分鐘,取雙層紗布過濾,取其濾液,加入瓊脂和葡萄糖(或蔗糖),用文火加熱使其溶化,最后補(bǔ)足水分,使其容量仍為1000毫升。趁熱分裝于試管中,裝量約為試管長度的1/5左右,裝管時(shí)要注意不使培養(yǎng)基沾污試管壁和試管口。試管口塞上大小合適的棉花塞,塞入試管口內(nèi)的長度為棉塞總長的3/5。塞好棉塞后,每10支作一捆,用牛皮紙包扎好后,置鐵絲網(wǎng)籠中,然后進(jìn)行高壓滅菌。如作為孢子分離用,則將培養(yǎng)基分裝于三角瓶或培養(yǎng)皿中,然后高壓滅菌。
3.母種培養(yǎng)基的消毒滅菌 母種培養(yǎng)基通常用高壓蒸汽滅菌鍋來消毒滅菌,常用的高壓蒸汽滅菌鍋有直式、臥式和手提式三種。將配制好后的母種培養(yǎng)基移入上述任何一種高壓蒸汽滅菌鍋中,在15公斤/平方厘米 壓力下,消毒滅菌30分鐘。
高壓蒸汽滅菌主要是依靠提高蒸汽的溫度來滅菌的,因此滅菌時(shí),應(yīng)將鍋內(nèi)的冷空氣全部排除。否則,盡管壓力表上的壓力已達(dá)到要求,然而,滅菌鍋內(nèi)的溫度卻未達(dá)到所需的溫度。排除冷空氣的方法是加熱后當(dāng)壓力表上指針上升到0.5公斤/平方厘米時(shí),打開排氣閥,放氣至指針仍回到“零”的位置。滅菌的時(shí)間是以排除冷空氣后,壓力回升到1.5公斤/平方厘米 時(shí)才開始計(jì)算。每次滅菌之后,要等壓力降到“零”時(shí),才打開鍋蓋,否則,滅菌的液體會(huì)因突然減壓而外溢,玻璃器皿也會(huì)因突然降溫而破裂。
高壓滅菌時(shí)壓力的換算及其與溫度的關(guān)系
磅/平方英寸
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公斤/平方厘米
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滅菌器中的溫度(℃)
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排除空氣
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未排除空氣
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5
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0.352
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108.4
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72
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10
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0.703
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115.2
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90
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15
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1.055
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121.0
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100
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20
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1.406
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126.0
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109
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25
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1.758
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130.4
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115
|
30
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2.109
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134.5
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121
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在沒有高壓蒸汽滅菌鍋設(shè)備的情況下,可用蒸鍋、蒸籠等進(jìn)行常壓滅菌。由于密封性差,壓力升不高,溫度只能升至102℃左右,因此要連續(xù)蒸4~6小時(shí)才能達(dá)到滅菌的目的。
高壓嚴(yán)菌后將試管取出排成斜面?zhèn)溆谩?/div>
(二)母種分離材料的選擇
1.子實(shí)體的選擇 無論是用作孢子分離或組織分離的子實(shí)體,都要從產(chǎn)量高,長勢好,適應(yīng)性強(qiáng),無雜菌蟲害的群體中,選擇朵大,生長健壯的單生子實(shí)體作為分離的材料。
選作分離的子實(shí)體,成熟度要適當(dāng),如蘑菇、草菇具有菌膜,最好選菌膜將破而未破的成熟度,這種子實(shí)體發(fā)育已成熟,子實(shí)層又未受污染,因此能很快散出大量的無菌孢子。對沒有菌膜或菌膜自幼已破的食用菌,如香菇、平菇等,則以選取八分熟,正在釋放孢子的個(gè)體為最好;因?yàn)閯倧膿?dān)子彈射出來的孢子基本上也是無菌的。
2.菇木和耳本的選擇 木生食用菌如香菇、銀耳、黑木耳等,可以從它們生長的基質(zhì),即菇木和耳木作為分離的材料。選擇時(shí),應(yīng)從野生或人工栽培場所挑選子實(shí)體生長健壯,朵大,長勢好,菌絲在段木中發(fā)育旺盛,材質(zhì)較為結(jié)實(shí),尚未腐爛,一般是接種后一年內(nèi)已出菇、出耳而無雜菌害蟲感染的幼齡菇木或耳木為最好。采去子實(shí)體后,截取適當(dāng)部位,掛于通風(fēng)處風(fēng)干后,供分離時(shí)用。
(三)母種的分離方法
1.孢子分離法 是利用食用菌的有性孢子或無性孢子,萌發(fā)成菌絲,獲得細(xì)菌種的一種方法。按分離時(shí)挑取孢子的數(shù)目不同,又分為單孢子分離法和多孢子分離法兩種。蘑菇、草菇等由于孢子沒有性的區(qū)別,采用單孢子分離獲得純菌種,有結(jié)實(shí)能力,而其它食用菌如香菇、銀耳、黑木耳等由于孢子有性別之分,單孢子分離得到的菌絲不能結(jié)實(shí),所以,只在育種上采用,生產(chǎn)上很少采用。多孢子分離法,是把許多孢子接種于同一培養(yǎng)基上,讓它們萌發(fā),自然交配而獲得純種,操作簡單易學(xué),生產(chǎn)上經(jīng)常采用。由于采集孢子的方法不同又分為如下幾種:
(1)采集器孢子彈射法 采集孢子的裝置可用玻璃鐘罩或玻璃漏斗做成。蘑菇和香菇常用這種方法采集孢子。具體做法是:把玻璃鐘罩或玻璃漏斗,放在一個(gè)墊有幾層紗布的瓷 盤上,內(nèi)放培養(yǎng)皿和不銹鋼支架(漏斗內(nèi)也可倒掛鐵絲代支 架),上端通氣孔用棉花塞住,然后用二層大紗布將整個(gè)裝置包起來,高壓滅菌后;移入無菌室備用。分離時(shí)把選好的種菇(八、九分成熟),切去菌柄基部送入無菌室,用0.1%~0.2%的升汞溶液或75%的酒精表面消毒1~2分鐘后,放在無菌水中漂洗,除去表面藥液,再用滅菌紗布揩手,插到不銹鋼支架上或鐵絲構(gòu)上,靜置1~2天,菌褶上的孢子大量散落到培養(yǎng)皿內(nèi),形成一層粉末狀孢子印時(shí),取下種菇,用滅菌的注射器,吸取3~5毫升無菌水,注入盛有孢子的培養(yǎng)皿中,輕輕攪動(dòng),便孢子均勻地懸浮于水上,再將注射器插上針頭,吸取沉于底部的飽滿孢子,注l~2滴懸液于試管斜面培養(yǎng)基,并使其均勻分布于培養(yǎng)基表面;蛴媒臃N針挑取少量的孢子直接在斜面培養(yǎng)基上劃線。待孢子萌發(fā),生成菌落時(shí),選孢子萌發(fā)快,生長良好的菌落,移接到新的斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
(2)三角瓶約懸法 銀耳、黑木耳常用此法采集孢子。茲以銀耳為例,介紹其具體做法如下:選朵大、雪白、無病蟲害的新鮮銀耳,作為種耳,經(jīng)無菌水漂洗種耳數(shù)次后,用無菌吸水紙把種耳表面的水分吸干。再把種耳切成一小塊,以入瓶后不會(huì)碰到瓶壁為度,掛在用火焰滅菌過的小金屬絲鉤(或不銹鋼鉤)上,迅速懸掛在三角瓶內(nèi),注意勿使種耳磁到培養(yǎng)基,以防雜菌污染。塞上棉塞,放在20~25℃條件下,經(jīng)l~2天,就可看到培 養(yǎng)基上形成一個(gè)霧狀孢子印。此時(shí),以無菌操作把懸掛瓶內(nèi)的耳片取出,再塞上棉塞,移到20~25℃的室中培養(yǎng),經(jīng)2~3天,培養(yǎng)基表面就會(huì)出現(xiàn)許多乳白色糊狀的白落,就是銀耳的分生孢子。
采用孢子分離,要注意控制培養(yǎng)的溫度。因?yàn)槭秤镁咦拥膹椛渑c培養(yǎng)的溫度有密切關(guān)系,如雙孢蘑菇孢子彈射最適溫度是14~18℃,如培養(yǎng)在25℃條件下,孢子就很難彈出。一般食用菌孢子彈射的最適溫度比菌絲體生長的最適溫度為低,而與子實(shí)體發(fā)育的最適溫度大致相同。如香菇孢子彈射的最適溫度為12~18℃,銀耳為20~24℃,黑木耳為20~26℃,平菇為13~20℃。
此外,孢子采集還可采用菌褶涂抹法,適用于野外采種,方法簡便,效果也好,即選成熟的種菇,用接種針直接插入褶片間,輕輕涂抹褶片表面尚未彈射的孢子,然后在試管培養(yǎng)基上接種。
2.組織分離法 是用食用菌幼嫩的組織塊直接分離培養(yǎng)成純菌種的方法。選用的子實(shí)體先經(jīng)0.1%開汞水或70%酒精表面消毒后。用無菌水沖洗并用無菌紗布擦去表面水分。分離香菇時(shí)用無菌解剖刀自菌柄處切開少許,再用手將子實(shí)體掰開為二,在菌蓋與菌褶交界處,切取0.3~0.4立方厘米的一小塊菌肉,移放在斜面培養(yǎng)基中央。如已開傘的種菇、則選菌蓋與菌柄交界處的菌肉。分離草菇時(shí),用無菌解剖刀把菌蕾縱切少許;再用手把菌蓋輕輕剝開,在菌柄上方和菌蓋交界處,切取1~5毫米的細(xì)塊,接在斜面培養(yǎng)基中。如種菇已受雨淋,吸水較多,應(yīng)取菌褶作為接種材料。組織分離后將試管外面放在恒溫箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍萌發(fā)出菌絲,并向 培養(yǎng)基蔓延生長后,再挑取生長健壯的菌絲進(jìn)行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。組織分離法操作簡便,又不易帶入雜菌,容易獲得純菌種。但對銀耳、黑木耳等膠質(zhì)菌;因其子實(shí)體中菌絲的含量極少,如用組織分離培養(yǎng),則往往不易成功。
3.基內(nèi)菌絲分離法 是利用食用菌生長的基質(zhì)一菇木和耳木作為分離材料,而培養(yǎng)成純菌種的方法。特別是銀耳、黑木耳采用這種方法,成功率高,性狀也較穩(wěn)定,為生產(chǎn)上經(jīng)常采用的方法。具體做法是從野生或人工栽培的場所,選擇子實(shí)體發(fā)生早,生長旺盛,朵大,無病蟲害的菇木或耳木,鋸取一小段,讓其充分風(fēng)干后備用。分離時(shí)如為香菇的菇木,先鋸取1厘米的薄片,切去四周,用0.1%升汞水表面消毒1~2分 鐘,用無菌刀將其劈成小木片,再切成0.5平方厘米的小木條,移入試管斜面培養(yǎng)基上,經(jīng)25~27℃培養(yǎng),菌絲生長后,再行轉(zhuǎn)管培養(yǎng)。
分離時(shí)如為銀耳的耳木,先從長有子實(shí)體部位,鋸取1~2厘米厚的木片,剔除樹皮及耳基,再用0.1%升汞水或70%酒精涂擦表面消毒,通過耳基著生處,把耳木縱切為二,用無菌刀在耳基著生處,削取極小的木屑,移入試管斜面培養(yǎng)基上。接種后放在20~28℃的溫度下培養(yǎng),數(shù)天后接種塊的周 圍開始長出纖細(xì)的白色菌絲,延伸到培養(yǎng)基后,培養(yǎng)基的顏色逐漸變黃轉(zhuǎn)黑,表面出現(xiàn)淺灰色斑紋,這就是羽毛狀菌絲。一星期后,小木屑上出現(xiàn)白色短絨毛狀菌絲,同時(shí)分泌白色或淡黃色水珠,這就是銀耳的發(fā)育菌絲。挑取銀耳發(fā)育菌絲和少 許羽毛狀菌絲轉(zhuǎn)接于新的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)接,一星期后,菌絲長滿試管,即成為母種。在實(shí)際分離中往往不可能得到銀耳菌絲與羽毛狀菌絲兩者兼有的母種;蚣?yōu)殂y耳菌絲; 或純?yōu)橛鹈珷罹z;或酵母狀分生孢子,還有相當(dāng)數(shù)量是感染雜菌或不長任何菌絲的。純銀耳菌絲和純羽毛狀菌絲,經(jīng)適當(dāng)配合后,就可應(yīng)用于生產(chǎn)。
黑木耳的耳木分離,其操作方法與銀耳大致相同,但不象銀耳有多種類型的菌絲。耳木接入試管后,一般放在22~28℃培養(yǎng)2~3天,可見菌絲長出。選生長健壯、清楚、兩端展整齊的,進(jìn)行轉(zhuǎn)管純化2~3次培育成母種。在培養(yǎng)過程中,有時(shí)培養(yǎng)基背面會(huì)出現(xiàn)乳白色或淡褐色,這是正常現(xiàn)象。
(四)母種的擴(kuò)大培養(yǎng)
從分離獲得或外地引入的優(yōu)良母種,由于數(shù)量有限不能滿足生產(chǎn)上的需要,應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)大繁殖培養(yǎng)。其方法是以無菌操作把斜面培養(yǎng)基連同菌絲體切成短米粒大的小塊,移接到新的斜面培養(yǎng)基上,在適溫條件下培養(yǎng),待菌絲長滿斜面時(shí)即成。一般每支母種試管可擴(kuò)大繁殖60~80支新管。擴(kuò)大母種第一次應(yīng)多些,以避免多次轉(zhuǎn)管,造成菌絲生活力降低,結(jié)菇(耳)少,影響產(chǎn)量和質(zhì)量。一般要求轉(zhuǎn)管不要超過五次。
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