法國(guó)人莫瑞爾(G.M. Morel)首先將組織培養(yǎng)的技術(shù)應(yīng)用在蘭花上,采取莖頂組織進(jìn)行培養(yǎng),經(jīng)由類原球體而獲得植株。
利用組織培養(yǎng)進(jìn)行芽體增殖是另一個(gè)獲取種苗的方法,例如,蝴蝶蘭便利用花梗芽進(jìn)行繁殖,這種方法的缺點(diǎn)是繁殖的效率較差,而且成本較高。由于芽體是經(jīng)由多細(xì)胞發(fā)育而成,并不適合做為基因轉(zhuǎn)殖的材料。以單細(xì)胞做為基因轉(zhuǎn)殖的起始點(diǎn)是最好的方式,而且可以避免得到嵌鑲體。不過(guò),目前以細(xì)胞來(lái)復(fù)制蘭花還只局限于幾個(gè)種類,如文心蘭、素心蘭及蝴蝶蘭等,無(wú)法廣泛使用。
以細(xì)胞復(fù)制蘭花
以細(xì)胞復(fù)制文心蘭為例,可以采取花梗、根、莖及葉做為培植體,將這些培植體置于合適的人工培養(yǎng)基,一至兩個(gè)月后,愈傷組織從根尖、莖及葉培植體的切口部位長(zhǎng)出。這些誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織可以不斷地繼代培養(yǎng)于相同的培養(yǎng)基,形成更多的愈傷組織,而且數(shù)年之內(nèi)仍具有再生植株的能力。如此一來(lái),我們便可以維持復(fù)制文心蘭的系統(tǒng),不需要每次都從培植體去誘導(dǎo)新的愈傷組織。
獲得大量愈傷組織后,便要進(jìn)行體胚誘導(dǎo)的工作。一般而言,誘導(dǎo)體胚所需要的培養(yǎng)基配方會(huì)不同于繼代培養(yǎng)時(shí)所用的。將愈傷組織轉(zhuǎn)移至誘導(dǎo)體胚的培養(yǎng)基,大約一個(gè)月后,可以觀察體胚的形成。理論上,每個(gè)細(xì)胞都可以產(chǎn)生一個(gè)體胚,所以一小塊愈傷組織便可以誘導(dǎo)出數(shù)十甚至數(shù)百個(gè)體胚。
接下來(lái)的工作便是將這些體胚培育成為完整的小植株,通常需將體胚轉(zhuǎn)移至另一不同配方的培養(yǎng)基。體胚逐漸發(fā)育形成原球體。這些自體細(xì)胞而來(lái)的原球體和種子發(fā)育而來(lái)的原球體,在形態(tài)及發(fā)育能力上并沒(méi)有明顯的差異,兩者皆可以發(fā)育成為正常的植物。只是同一來(lái)源的體細(xì)胞所形成的原球體具有相同的遺傳組成,而種子來(lái)源的原球體則皆具有不同的遺傳組成。數(shù)個(gè)月后,原球體發(fā)育成為具有地下部及地上部的小植株,待小植株成長(zhǎng)至一定大小后,便可以進(jìn)行馴化的工作。將小植株移出瓶外,種植于栽培容器并移至具有遮陰及噴霧設(shè)施的溫室進(jìn)行馴化,可以得到將近百分之百的存活率。
除了以細(xì)胞復(fù)制文心蘭之外,素心蘭、蝴蝶蘭及拖鞋蘭等都可以經(jīng)由愈傷組織誘導(dǎo)出小植株,這些小植株也都能正常的生長(zhǎng)。素心蘭的愈傷組織是從根莖等營(yíng)養(yǎng)器官誘導(dǎo)而來(lái)的,愈傷組織在繼代的過(guò)程中形成體胚,這些體胚并不形成原球體而是發(fā)育成為根莖,然后才形成小植株。雖然蝴蝶蘭及拖鞋蘭都可以利用愈傷組織來(lái)繁殖,但未來(lái)仍需進(jìn)一步以營(yíng)養(yǎng)器官或組織來(lái)誘導(dǎo)愈傷組織,才能針對(duì)特定的優(yōu)良品種進(jìn)行繁殖。
葉細(xì)胞再生植株
除了藉由誘導(dǎo)愈傷組織來(lái)再生小植株之外,還有另外一種不需經(jīng)由愈傷組織便可以誘導(dǎo)培植體形成體胚發(fā)生,進(jìn)而再生植株的方法,這種過(guò)程稱為直接體胚發(fā)生。文心蘭葉片的直接體胚發(fā)生是蘭科植物中,唯一曾被報(bào)導(dǎo)的例子。誘導(dǎo)的方法非常簡(jiǎn)單,將文心蘭的葉片切下做為培植體,培養(yǎng)在一般不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基,大約一個(gè)月后,葉片的尖端、上表面及切口部位可形成體胚,將帶有體胚的葉片繼代至相同的培養(yǎng)基,經(jīng)過(guò)數(shù)星期之后,體胚發(fā)育成為原球體,原球體逐漸抽芽長(zhǎng)大,最后則形成正常的小植株,移至塑料盆內(nèi)進(jìn)行馴化,可以得到高存活率。
以掃描式電子顯微鏡觀察體胚的形態(tài),可以看到大量的體胚從葉表面長(zhǎng)出,這些體胚大小不一,顯示并異步形成,初期形狀有一點(diǎn)像釋迦果。除了葉表面之外,葉尖端也是一個(gè)很容易形成體胚的部位。
以直接體胚發(fā)生來(lái)繁殖文心蘭具有多項(xiàng)優(yōu)點(diǎn),首先是這種方法的繁殖速率較快,從誘導(dǎo)培植體形成體胚至小植株出瓶馴化,最快僅需五到六個(gè)月左右的時(shí)間。此外,經(jīng)由直接體胚發(fā)生所獲得的小植株之變異機(jī)率較低,因?yàn)橛鷤M織經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的繼代,在生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑或高鹽類等條件刺激下,容易導(dǎo)致體細(xì)胞變異,遺傳物質(zhì)產(chǎn)生改變的體細(xì)胞會(huì)再生出變異的小植株,而葉細(xì)胞直接形成體胚則比較穩(wěn)定。
在合適的條件下,理論上每個(gè)葉細(xì)胞都會(huì)形成一個(gè)體胚,一片葉子便可以復(fù)制出成千上萬(wàn)棵性狀及遺傳物質(zhì)相同的小植株,而這些小植株的葉片也可以再用來(lái)誘導(dǎo)體胚發(fā)生。如果在場(chǎng)地及人力等條件都能配合的情況下,繁殖倍率可以等比級(jí)數(shù)上升,想要有多少種苗都不成問(wèn)題。如果能將這種繁殖方法應(yīng)用在其它的蘭花上,有一天當(dāng)我們看到一棵非常漂亮的蘭花,只要想辦法取得它一小片葉子,便可以很快地復(fù)制出許多一模一樣的蘭花了。