幾乎所有植物中都存在淀粉酶，尤其是萌發(fā)的禾谷類種子，淀粉酶活性最強。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。種子萌發(fā)時，淀粉酶活性隨萌發(fā)時間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類，供幼苗生長。α-淀粉酶隨機水解淀粉的α-1,4-糖苷鍵，作為淀粉分解的起始酶而起主要作用；其水解產(chǎn)物為麥芽糖、麥芽三糖、糊精等還原糖；β-淀粉酶水解非還原端的第二個α-1,4-糖苷鍵，水解產(chǎn)物為麥芽糖，并能使一部分糊精糖化。本實驗以萌發(fā)種子為材料，測定其中α-淀粉酶和β-淀粉活性的差異。
【原理】
兩種淀粉酶具有不同理化特性，α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速鈍化；β-淀酶不耐熱，在70℃下15min則被鈍化。據(jù)此，在測定時鈍化其中之一，就可以測定出另一種酶的活力，本實驗采用加熱鈍化β-淀粉酶測出α-淀粉酶活力，再與非鈍化條件下測得的總淀粉酶活力比較，求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糖及其它還原糖能與3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原生成紅色3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。
【儀器與用具】
分光光度計；離心機；恒溫水��；研缽；具塞刻度試管（25ml×13）；刻度吸管（1ml，2ml，5ml各1支）；容量瓶（50ml×2）。
【試劑】
麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/ml）：稱取100mg麥芽糖，用蒸餾水溶解并定容至100ml；
DNS試劑（3,5-二硝基水楊酸）：精確稱取3,5-二硝基水楊酸1g，溶于20ml 12mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸餾水，再加入30g酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水定容至100ml。蓋緊瓶塞，勿使CO2進入。若溶液混濁可過濾后使用；
0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液：
A液（0.1mol/L檸檬酸）—稱取分析純檸檬酸21.01g，用蒸餾水溶解并定容至1L；
B液(0.1mol/L檸檬酸鈉)—稱取檸檬酸鈉29.41g用蒸餾水溶解并定容至1L；
取A液55ml與B液145ml混勻，即為0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液；
1%淀粉溶液：稱取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的檸檬酸緩沖液中。
【方法】
1.酶液提�。悍Q取25℃下萌發(fā)3～4天的小麥種子1.0g（芽長1.0~1.5cm），置研缽中，加少量石英砂和2ml蒸餾水，研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入離心管中，用7ml蒸餾水分次將殘渣洗入離心管提取液在室溫下放置提取15～20min，每隔數(shù)分鐘攪動1次，使其充分提取。然后在3000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，將上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，即為淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度搖勻，即為淀分酶稀釋液。
2.麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：取7支干凈的具塞刻度試管，編號，按表33-1加入試劑。
表33-1 制作麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線配方表
|
試 劑
|
管 號
|
||||||
|
1
|
2
|
3
|
4
|
5
|
6
|
7
|
|
|
麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液(ml)
|
0
|
0.2
|
0.4
|
0.8
|
1.2.
|
1.6
|
2.0
|
|
蒸餾水(ml)
|
2.0
|
1.8
|
1.6
|
1.2
|
0.8
|
0.4
|
0
|
|
麥芽糖含量(mg)
|
0
|
0.2
|
0.4
|
0.8
|
1.2
|
1.6
|
2.0
|
|
3,5-二硝基水楊酸(ml)
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
2
|
搖勻，置沸水中浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20ml。以1號管作為空白調(diào)零點，在540nm波長下比色測定。以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.酶活力的測定：取6支干凈的具塞刻度試管,編號,按表33-2進行操作。
表33-2 配活力的測定配方表
|
操作項目
|
管 號
|
||||||
|
Ⅰ-1
|
Ⅰ-2
|
Ⅰ-3
|
Ⅱ-1
|
Ⅱ-2
|
Ⅱ-3
|
||
|
淀粉酶原液(ml)
|
1.0
|
1.0
|
1.0
|
0
|
0
|
0
|
|
|
鈍化β-淀粉酶
|
置70℃水浴中15min，取出后在流水中冷卻
|
||||||
|
淀粉酶稀釋液(ml)
|
0
|
0
|
0
|
1
|
1
|
1
|
|
|
DNS試劑(ml)
|
2.0
|
0
|
0
|
2.0
|
0
|
0
|
|
|
預(yù)保溫
|
40℃恒溫水浴中保溫10min
|
||||||
|
1%淀粉溶液(ml)(40℃)
|
1.0
|
1.0
|
1.0
|
1.0
|
1.0
|
1.0
|
|
|
保溫
|
40℃恒溫水浴中準(zhǔn)確保溫5min
|
||||||
|
DNS試劑(ml)
|
0
|
2.0
|
2.0
|
0
|
2.0
|
2.0
|
|
搖勻，置沸水浴中5min，取出后冷卻，加蒸餾水至20ml。搖勻，在540nm波長下比色，記錄測定結(jié)果。
4.結(jié)果計算：用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值與Ⅰ-1吸光度值之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量（mg），再按下式計算α-淀粉酶的活力（Aα），淀粉酶活性以麥芽糖mg·g﹣1·min﹣1表示：
Aα=
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值與Ⅱ-1吸光度值之差，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量（mg），按下式計算（α β）-淀粉酶總活力AT：
AT＝
式中 A—淀粉酶活性，Aα為α-淀粉酶的活性，AT為淀粉酶總活性，主要是α、β淀粉酶的活性；
Cα—α-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖量（查標(biāo)準(zhǔn)曲線求值，以下同）；
CT—（α β）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖量；
V1—顯色所用酶液體積（ml）；
t—酶作用時間（min）；
Vt—樣液稀液總體積（α-淀粉酶為50ml,α β淀粉酶為500ml）；
FW—樣品鮮重（g）。