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姐妹染色單體差別染色

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

姐妹染色單體區(qū)分染色法(Sister chromatid differentiation,SCD)是70年代中期發(fā)展起來(lái)的染色體處理技術(shù)。Latt(1973)在培養(yǎng)的細(xì)胞中加入5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU),當(dāng)用Hoechst33258 熒光染料染色時(shí),發(fā)現(xiàn)了姊妹染色單體的色差反映和它們之間互換的現(xiàn)象。1974年KO Renberg和Froeed-Lender改進(jìn)了這一技術(shù),建立了較簡(jiǎn)易的BrdU-Giemsa技術(shù)。這種技術(shù)用于研究細(xì)胞周期、染色體半保留復(fù)制、染色體的分子結(jié)構(gòu)和畸變,以及DNA的復(fù)制、損傷與修復(fù)等一系列重要理論問(wèn)題,還可以用于分析姊妹染色單體互換(Sister chromatid exchange, SCE)頻率。由于SCE能靈敏地檢測(cè)染色體的變化,表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系。因此,目前已把SCE列為檢測(cè)致突變物、致癌物地常規(guī)指標(biāo)之一。
一、原理
5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxy-urdine, BrdU)在DNA的復(fù)制過(guò)程中,摻入新合成的鏈并占有胸腺嘧啶(thymidine, T)的位置。根據(jù)DNA的半保留復(fù)制規(guī)律,哺乳動(dòng)物或人的細(xì)胞在BrdU的培養(yǎng)液中經(jīng)歷了兩個(gè)周期后,它的兩條姊妹染色單體的DNA雙鏈在化學(xué)組成上有了差別。當(dāng)染色體的DNA鏈的兩條多核苷酸鏈都被BrdU所替換,Giemsa染色顯示淺色,如果染色體的DNA鏈中僅有一條多核苷酸鏈被BrdU所替換,Giemsa染色顯示深色。應(yīng)用姊妹染色單體區(qū)分染色法(SCD)研究來(lái)自一個(gè)染色體的兩條單體之間在同一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生同源片段的交換,稱為姊妹染色單體互換。
二、用品和試劑
45℃水浴,紫外線燈(20W)。余同外周血染色體制備。
試劑: BrdU溶液:用無(wú)菌青霉素瓶,在普通條件下稱取BrdU 2mg,然后在無(wú)菌室內(nèi)加入無(wú)菌生理鹽水4ml,用黑紙避光,4℃冰箱保存,新鮮配置。1×SSC溶液:0.15mol/L NaCl,0.015mol/L 檸檬酸鈉。
三、操作步驟
l.細(xì)胞培養(yǎng):常規(guī)培養(yǎng)人外周血淋巴細(xì)胞,24h后,加入BrdU使其終濃度為20μg/ml。
2.繼續(xù)避光培養(yǎng)48小時(shí),終止培養(yǎng)前2—3小時(shí)加秋水仙堿。
3.培養(yǎng)結(jié)束收獲細(xì)胞,常規(guī)制備染色體,操作同實(shí)驗(yàn)一。
4.染色體制片在37℃恒溫箱內(nèi)老化24小時(shí)或室溫放置1—2天。
5.將染色體制片的玻片正面向上平鋪在恒溫(45℃)水浴鍋上,在玻片上滴加已預(yù)熱至45℃的1×SSC溶液。
6.將紫外燈放在恒溫水浴上,燈與標(biāo)本垂直,其外加蓋報(bào)紙數(shù)張以阻擋紫外線。照射距離為6cm,時(shí)間15min。
7.照射完畢后以蒸餾水洗去1×SSC。
8.1∶10 Giemsa染色5分鐘。
9.自來(lái)水細(xì)流沖洗去多余染料,干燥,鏡檢。
10.計(jì)數(shù)SCE。選擇染色體分散較好,數(shù)目為46的中期分裂相20個(gè)進(jìn)行觀察計(jì)數(shù),凡在染色單體端部出現(xiàn)的互換計(jì)為一次SCE,在染色單體中間出現(xiàn)的互換計(jì)為兩次SCE。凡在著絲粒部位發(fā)生一次互換,判斷不是兩條染色單體在著絲粒部發(fā)生的扭轉(zhuǎn),計(jì)為一次SCE,但另列入“著絲粒區(qū)互換(CME)”一項(xiàng)。

 

 

 
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