時(shí)間分辨熒光分析法(Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA)是近十年發(fā)展起來的一測微量分析方法,是目前最靈敏的微量分析技術(shù),其靈敏度高達(dá)10-19,較放射免疫分析(RIA)高出3個(gè)數(shù)量級。
時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)實(shí)際上是在熒光分析(FIA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它是一種特殊的熒光分析。熒光分析的利用了熒光的波長與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響,同時(shí),熒光分析與普通分光不同,光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上,激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器,從而大幅度的提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是,當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候,激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此,解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。
解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測量時(shí)沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短,激發(fā)光消失,熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長,可達(dá)1-2ms,能夠滿足測量要求,因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法,即使用長效熒光標(biāo)記物,在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強(qiáng)度的分析方法。
平時(shí)常用的稀土金屬主要是Eu(銪)和Tb(鋱),Eu熒光壽命1ms,在水中不穩(wěn)定,但加入增強(qiáng)劑后可以克服;Tb熒光壽命1.6ms,水中穩(wěn)定,但其熒光波長短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解,因此從測量方法學(xué)上看Tb很好,但不適合用于生物分析,故Eu最為常用。
由于常用Eu作為熒光標(biāo)記,因此增強(qiáng)劑就成了試劑中的重要組成。增強(qiáng)劑原理:利用含絡(luò)合劑、表面活性劑的溶液的親水和親脂性同時(shí)存在,使Eu在水中處于穩(wěn)定狀態(tài),F(xiàn)在有些試劑,在絡(luò)合Eu在抗體上時(shí)已考慮了增強(qiáng)問題,而使用了具有增強(qiáng)作用的新絡(luò)合劑,因而有的試劑沒有單獨(dú)的增強(qiáng)劑。
隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,對微量、超微量的測定會越來越多,同時(shí)RIA的污染問題會越來越被重視,因此,時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)具有越來越大的應(yīng)用空間。
時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)實(shí)際上是在熒光分析(FIA)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的,它是一種特殊的熒光分析。熒光分析的利用了熒光的波長與其激發(fā)波長的巨大差異克服了普通紫外-可見分光分析法中雜色光的影響,同時(shí),熒光分析與普通分光不同,光電接受器與激發(fā)光不在同一直線上,激發(fā)光不能直接到達(dá)光電接受器,從而大幅度的提高了光學(xué)分析的靈敏度。但是,當(dāng)進(jìn)行超微量分析的時(shí)候,激發(fā)光的雜散光的影響就顯得嚴(yán)重了。因此,解決激發(fā)光的雜散光的影響成了提高靈敏度的瓶頸。
解決雜散光影響的最好方法當(dāng)然是測量時(shí)沒有激發(fā)光的存在。但普通的熒光標(biāo)志物熒光壽命非常短,激發(fā)光消失,熒光也消失。不過有非常少的稀土金屬(Eu、Tb、Sm、Dy)的熒光壽命較長,可達(dá)1-2ms,能夠滿足測量要求,因此而產(chǎn)生了時(shí)間分辨熒光分析法,即使用長效熒光標(biāo)記物,在關(guān)閉激發(fā)光后再測定熒光強(qiáng)度的分析方法。
平時(shí)常用的稀土金屬主要是Eu(銪)和Tb(鋱),Eu熒光壽命1ms,在水中不穩(wěn)定,但加入增強(qiáng)劑后可以克服;Tb熒光壽命1.6ms,水中穩(wěn)定,但其熒光波長短、散射嚴(yán)重、能量大易使組分分解,因此從測量方法學(xué)上看Tb很好,但不適合用于生物分析,故Eu最為常用。
由于常用Eu作為熒光標(biāo)記,因此增強(qiáng)劑就成了試劑中的重要組成。增強(qiáng)劑原理:利用含絡(luò)合劑、表面活性劑的溶液的親水和親脂性同時(shí)存在,使Eu在水中處于穩(wěn)定狀態(tài),F(xiàn)在有些試劑,在絡(luò)合Eu在抗體上時(shí)已考慮了增強(qiáng)問題,而使用了具有增強(qiáng)作用的新絡(luò)合劑,因而有的試劑沒有單獨(dú)的增強(qiáng)劑。
隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展,對微量、超微量的測定會越來越多,同時(shí)RIA的污染問題會越來越被重視,因此,時(shí)間分辨熒光分析法(TRFIA)具有越來越大的應(yīng)用空間。