前段時間,經(jīng)歷了幾個月的時間,為實驗室建了一個細(xì)胞培養(yǎng)間。目前這個細(xì)胞培養(yǎng)間運(yùn)轉(zhuǎn)良好,培養(yǎng)的神經(jīng)元長了10來天,長勢不錯,已經(jīng)可以認(rèn)為細(xì)胞培養(yǎng)室建立成功。在建立細(xì)胞培養(yǎng)間的過程中,碰到了許多問題,逐一解決后,覺得大家如果要建立細(xì)胞培養(yǎng)間,肯定也會碰到許多相同的問題,所以將我碰到的問題整理出來。首先向大家推薦一本書,個人認(rèn)為是比較經(jīng)典的——《動物細(xì)胞培養(yǎng)-基本技術(shù)指南》科學(xué)出版社,英,R.I.弗雷謝尼。內(nèi)容不多,但以下的資料大部分是書上找不到的。
2005-4-30
陸新江
一、建細(xì)胞間的一些細(xì)節(jié)問題:
1、甲醛薰蒸:
資料(internet):
40%甲醛溶液(藥用規(guī)格、福建三明化工總廠出品),用量30 ml/m3,室內(nèi)溫度21~24℃,相對濕度75%~85%,加熱薰蒸使蒸汽彌漫全室,關(guān)閉門窗1 h。
甲醛水溶液為無色,具有強(qiáng)烈刺激性氣味的液體,可殺滅多數(shù)微生物,價廉,熏蒸消毒時不損壞衣服、家具、皮革、橡膠等。市售的甲醛水溶液中一般含37-40%的甲醛。其主要用法為:
1.熏蒸消毒: 對室內(nèi)消毒其用量為20-25%毫升/米,在加熱該溶液時最好同時煮沸一壺水,使室內(nèi)相對溫度保持在70-90%左右,室內(nèi)溫度最好在20攝氏度以上,作用時間12-24小時。如消毒皮毛服裝,甲醛水溶液的用量可加至125毫升/米,掛衣密度為每平方米3套為宜。熏蒸消毒時應(yīng)密閉門窗。消毒后一般多用自然通風(fēng)驅(qū)散甲醛氣體,其需時較長,急于排出氣體,可將25%氨水加熱蒸發(fā)中和。氨水用量為所用甲醛水溶液的一半,中和時間為30分鐘。
2.自然揮發(fā): 將較大量的甲醛水溶液放入一敞開容器中,室內(nèi)溫度保持在18攝氏度以上,同時室內(nèi)噴水以保持相對濕度在70%以上,經(jīng)16小時可達(dá)到室內(nèi)消毒的目的。
關(guān)于甲酸、甲醛和甲醇三者的毒性比較:甲酸的毒性比甲醇大6倍,甲醛的毒性比甲醇大30倍。所以吃進(jìn)4~10克甲醇,就能引起慢性中毒。它的毒性作用主要表現(xiàn)在損傷視力,使視力減退(不能矯正),視野縮小,以致雙目失明,直到死亡。
實際操作:
我的每個房間是7個平方,約20個立方。按書上的算要福爾馬林300ml,高錳酸鉀100g。
高錳酸鉀放入甲醛液體中后,在開始的3秒鐘內(nèi)沒有反映,3秒鐘以后,會產(chǎn)生大量煙氣。所以一旦在甲醛中加了高錳酸鉀請馬上離開滅菌室,并關(guān)上門。
高錳酸鉀放入甲醛液體中會使液體沸騰,所以反應(yīng)要在比較大的大口徑容器進(jìn)行,本人用的是臉盆。
甲醛氣體毒性非常強(qiáng),所以操作時一定要帶上防毒面具。
2、關(guān)于紫外線:
資料:
紫外線的穿透能力非常弱的,主要靠電離產(chǎn)生氧自由基來消毒。細(xì)胞培養(yǎng)室里面一些不能照射紫外的物件可以用一般的材料蓋住。如:玻璃和有機(jī)玻璃都可以的。紫外有些人認(rèn)為大型精密的顯微鏡是不可以照紫外的,因為它們的鏡頭上涂的膜會被分解掉,但我特意問了我校光學(xué)系的老師,他們認(rèn)為是沒有關(guān)系的。
紫外線在許多實驗室被認(rèn)為是起心理安慰作用的。我參觀過的一個細(xì)胞培養(yǎng)間他們的房間大約6平方米,但是只裝了30W的紫外燈,但前提是他們有一個層流系統(tǒng)。
個人認(rèn)為,如果細(xì)胞培養(yǎng)間有層流系統(tǒng),那紫外的作用是可以被忽略的,但如果沒有層流系統(tǒng),那么紫外的作用還是相當(dāng)重要。
此外,不要擔(dān)心紫外不能照射到的角落,因為紫外殺菌功能除了紫外本身以外,還可以由產(chǎn)生的臭氧來完成。
臭氧過量吸入的作用應(yīng)該和雙氧水的作用是一樣的,個人認(rèn)為也許有一定的致癌性。所以紫外滅菌以后,最好過一個小時再進(jìn)去。
3、關(guān)于新潔爾滅:
資料:
【藥品名稱】苯扎溴銨溶液 (新潔而滅溶液) (乙類非處方藥【別 名】BenzalkoniumBromideSolution【標(biāo)準(zhǔn)來源】《中華人民共和國藥典》2000年版!拘 狀】 無色或淡黃色的澄明液體;芳香;味極苦;強(qiáng)力振搖能發(fā)生多量泡沫,遇低溫可能發(fā)生渾濁或沉淀!舅幬锝M成】每毫升含苯扎溴銨0.05克 (5%)!咀饔妙悇e】皮膚科用藥品。【藥理作用】苯扎溴銨為陽離子表面活性劑類廣譜殺菌劑!九R床應(yīng)用】用于皮膚黏膜和傷口的消毒。【用法用量】 外用,使用前應(yīng)稀釋即配即用。皮膚消毒使用0.1%溶液;創(chuàng)面黏膜消毒用0.01%溶液; 稀釋方法:0.1%溶液:取本品一份,加純化水或清水50份;0.01%溶液:取本品1份,加純化水或清水500份!咀⒁馐马棥 l. 本品為外用消毒防腐藥,不可內(nèi)服。2. 不得用塑料或鋁制容器貯存。3. 涂布部位如有灼燒感、瘙癢、紅腫等,應(yīng)停止用藥,洗凈。必要時向醫(yī)師咨詢。4. 低溫時,可能出現(xiàn)混濁或沉淀,可置于溫水中加溫,振搖使溶解后使用。5. 兒童必須在成人監(jiān)護(hù)下使用!静涣挤磻(yīng)】偶見過敏反應(yīng)。 【藥物相互作用】 l. 不得與肥皂或其他合成洗滌劑并用。2. 局部消毒時勿與碘酊、高錳酸鉀、雙氧水、磺胺粉等并用。 3. 如正在使用其他藥品,使用本品前請咨詢醫(yī)師或藥師!疽(guī) 格】500毫升﹕25克;100毫升﹕5克(5%)!举A 藏】避光,密封保存。
評論:在甲醛滅菌前,先用新潔爾來擦洗整個墻面,此外,平時地板滅菌也可以用它。新潔爾滅和酒精相比,最大的優(yōu)點是便宜,因為新潔爾滅500ml只需5元,而且可以稀釋50倍用,而同樣量的酒精價格可能是新潔爾滅的幾十倍。
二、培養(yǎng)準(zhǔn)備時的一些問題:
1、多聚賴氨酸:
資料:多聚賴氨酸溶液(Poly-L-Lysine Solution)
Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃
Thimerosal, 0.01%, added as preservative
多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑,該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強(qiáng)的黏合力。
適用組織學(xué),免疫組織化學(xué),冰凍切片,細(xì)胞涂片,原位雜交等使用的玻片的防脫片處理,以防實驗操作過程中組織掉片。也可用于細(xì)胞培養(yǎng),增加細(xì)胞貼壁能力。
[使用說明]
免疫學(xué)
操作步驟(可直接在玻片上涂布)
1. 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。
2. 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi),使其溫度到室溫18-26℃
3. 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。
4.在60℃烘箱1小時干燥,或室溫18-26℃過夜干燥待用。
[注意]
1. 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張, 超過90張片子將影響其黏合力。
2. 用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。
3. 不要在用過的稀釋液中加新的溶液。
4. 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8℃,至少在3個月內(nèi)是穩(wěn)定的。
5. 用過的稀釋液要過濾,若出現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。
2、洗液的一些問題:
資料:
重鉻酸鉀硫酸洗液
通常稱為洗潔液或洗液,其成分主要為重鉻酸鉀與硫酸,是強(qiáng)氧化劑。
K2Cr2O7 4H2SO4 K2SO4 Cr2(SO4)3 3[O]
因其有很強(qiáng)的氧化力,一般有機(jī)物如血、尿、油脂等類污遺跡可被氧化而除凈。事先將溶液稍微加熱,則效力更強(qiáng)。新鮮鉻酸洗液為棕紅色,若使用的次數(shù)過多,重鉻酸鉀就被還原為綠色的鉻酸鹽,效力減小,此時可加熱濃縮或補(bǔ)加重鉻酸鉀,仍可繼續(xù)使用。
配方:稀洗液 重鉻酸鉀 10g
粗濃硫酸 200ml
水 100ml
濃洗液 重鉻酸鉀 20g
粗濃硫酸 350ml
水 40ml
配法:先取粗制重鉻酸鉀20g,放于大燒杯內(nèi),加普通水100ml使重鉻酸鉀溶解(必要時可加熱溶解)。再將粗制濃硫酸(200ml)緩緩沿邊緣加入上述重鉻酸鉀溶液中即成。加濃硫酸時須用玻璃棒不斷攪拌,并注意防止液體外溢。若用瓷桶大量配制,注意瓷桶內(nèi)面必須沒有掉瓷,以免強(qiáng)酸燒壞瓷桶。配時切記,不能把水加于硫酸內(nèi)(將因硫酸遇水瞬間產(chǎn)生大量的熱量使水沸騰,體積膨脹而發(fā)生爆濺)。
使用時先將玻皿用肥皂水洗刷1~2次,再用清水沖凈倒干,然后放入洗液中浸泡約2小時,有時還需加熱,提高清潔效率。經(jīng)洗液浸泡的玻皿,可先用自來水沖洗多次,然后再用蒸餾水沖洗1~2次即可。
附有蛋白質(zhì)類或血液較多的玻皿,切勿用洗液,因易使其凝固,更不可對有如酒精、乙醚的容器用洗液洗滌。
洗液對皮膚、衣物等均有腐蝕作用,故應(yīng)妥善保存。使用時帶保護(hù)手套。為防止吸收空氣中的水分而變質(zhì),洗液貯存時應(yīng)加蓋。
注意:
洗液具有強(qiáng)烈的腐蝕性,接觸皮膚后會,皮膚會變黃,2天后會脫一層皮。
3、氟尿嘧啶:
別 名:5?氟尿嘧啶 英 文 名:Fluorouracil (5 FU)。作用與用途:本品為嘧啶類的氟化物,屬于抗代謝抗腫瘤藥,能抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶,阻斷脫氧嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶核苷核,干擾DNA合成。對RNA的合成也有一定的抑制作用。
操作:在神經(jīng)元培養(yǎng)時可以用來抑制膠質(zhì)的生長。
4、L-谷氨酰氨:
資料:
氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位.不同種類的細(xì)胞對氨基酸的要求各異,但有幾種氨
基酸細(xì)胞自身不能合成,必須依靠培養(yǎng)液提供,這幾種氨基酸稱為必需氨基酸.其中谷氨
酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸,在缺少谷氨酰胺時,細(xì)胞生長不良而死亡.
因此,各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺.但是,由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定,應(yīng)
置于-20℃冰箱中保存,在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi).已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲
存2周以上時,還應(yīng)重新加入原來量的谷氨酰胺.
三、海馬神經(jīng)元培養(yǎng)的方法:
操作步驟:
1.取 2ml 左右的L-多聚賴氨酸(0.1mg/ml) 包被培養(yǎng)板或coverlip;
2. 將出生小于24h的乳鼠6-8個用70%乙醇消毒,逐個斷頭,取腦,放入冰浴的解剖液中;
3. 用彎頭鑷鑷取海馬和皮層,去除腦膜和血管,分別放入干凈的平皿中,用手術(shù)刀片分別將海馬和皮層切細(xì)。
4. 將組織塊置于15ml解剖液配制的0.25%胰蛋白酶中,37ºC,靜置20min,取出時,勿搖晃。
5. 吸棄去上層胰酶液,下層組織沉淀約2ml, 加3ml種植液沖洗一遍。靜置約3分鐘。
6. 吸棄去上層液體,下層組織沉淀約2ml, 加3ml種植液沖洗一遍。離心800rpm×1min
7. 吸棄去上層液體,加2ml種植液
8. 用一根吸管,頭燒細(xì),冷卻,輕輕吹打約15-20次,制成細(xì)胞懸液。
9. 取50ul細(xì)胞懸液稀釋到1ml, 計數(shù)4大格。
10. 細(xì)胞濃度=4大格細(xì)胞數(shù)/4×稀釋倍數(shù)×104/ml
11. 例如120/4×20×104/ml=6×106/ml
12. 按照0.6--2×106/ml的密度接種神經(jīng)元。
13. 24h后全量換液成飼養(yǎng)液
14. 每三天用Neuronbasal使用液半量換液。
15. 接種后3-5天,加阿糖胞苷至終濃度10uM作用48小時,抑制膠質(zhì)細(xì)胞的過度生長。
注意事項
1 用L-多聚賴氨酸(0.1mg/ml) 包被培養(yǎng)板后,要待其干后才能接種,因為其對神經(jīng)元有毒性。L-多聚賴氨酸(0.1mg/ml)能回收再利用。
2 取腦組織時動作盡量要快,并且盡量低溫操作。
3 分離皮層和海馬時,要盡量分離腦膜和血管,否則有大量的成纖維細(xì)胞。
4 用吸管輕輕吹打細(xì)胞時,盡量不起泡沫,以免損傷神經(jīng)元。
5 接種細(xì)胞的過程,動作要快,以免細(xì)胞聚集。
6 接種細(xì)胞后,24h勿移動,以免影響細(xì)胞貼壁。
四 結(jié)果:
大多數(shù)神經(jīng)元在接種1h內(nèi)貼壁,3-5h開始變平,并長出1-2個突起。3天后,許多細(xì)胞從胞體長出數(shù)個突起。神經(jīng)元在7-10天開始成熟,胞體逐漸長至30-40um,暈光明顯,胞核和核仁清晰可見,突起變粗,變長并且有分支,邊緣清楚,發(fā)亮,形成明顯的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。神經(jīng)元可存活1-2月。