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細(xì)胞冷凍保存

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08
1. 注意事項(xiàng):
1.1. 欲冷凍保存之細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好(log phase) 且存活率高之狀態(tài),約為80 – 90 %致密度。
1.2. 冷凍前檢測(cè)細(xì)胞是否仍保有其特有性質(zhì),例如hybridoma 應(yīng)在冷凍保存前一至二日測(cè)試是否有抗體之產(chǎn)生。
1.3. 注意冷凍保護(hù)劑之品質(zhì)。DMSO 應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),無(wú)菌且無(wú)色(以0.22 micron FGLP Telflon 過(guò)濾或是直接購(gòu)買無(wú)菌產(chǎn)品,如Sigma D-2650),以5~10 ml 小體積分裝,4 oC 避光保存,勿作多次解凍。Glycerol 亦應(yīng)為試劑級(jí)等級(jí),以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內(nèi)使用,因長(zhǎng)期儲(chǔ)存后對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性。
1.4. 冷凍保存之細(xì)胞濃度:
1.4.1. normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2. hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml,細(xì)胞濃度不要太高,某些hybridoma 會(huì)因冷凍濃度太高而在解凍24 小時(shí)后死去。
1.4.3. adherent tumor lines: 5~7 x 106,依細(xì)胞種類而異。Adenocarcinoma 解凍后須較高之濃度,而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4. other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 須至少5 x 106 cells/ml。
1.5. 冷凍保護(hù)劑濃度為5 或10 % DMSO,若是不確定細(xì)胞之冷凍條件,在做冷凍保存之同時(shí),亦應(yīng)作一個(gè)backup culture,以防止冷凍失敗。
1.6. 冷凍方法:
1.6.1. 傳統(tǒng)方法: 4 oC 10 分鐘---> -20 oC 30 分鐘---> -80 oC 16 - 18 小時(shí)(或隔夜) ---> 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
1.6.2. 程序降溫:利用等速降溫機(jī)以–1 ~ -3 oC/分鐘之速度由室溫降至–120 oC,放在液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。適用于懸浮型細(xì)胞與hybridoma 之保存。
2. 材料:
2.1. 生長(zhǎng)良好之培養(yǎng)細(xì)胞
2.2. 新鮮培養(yǎng)基
2.3. DMSO (Sigma D-2650)
2.4. 無(wú)菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5. 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6. 血球計(jì)數(shù)盤與蓋玻片
2.7. 等速降溫機(jī)(KRYO 10 Series II)
3. 步驟:
3.1. 冷凍前一日前更換半量或全量培養(yǎng)基,觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情形。
3.2. 配制冷凍保存溶液(使用前配制):將DMSO 加入新鮮培養(yǎng)基中,最后濃度為5-10%,混合均勻,置于室溫下待用。
3.3. 依細(xì)胞繼代培養(yǎng)之操作,收集培養(yǎng)之細(xì)胞,取少量細(xì)胞懸浮液(約0.1 ml) 計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度及凍前存活率。
3.4. 離心,去除上清液,加入適量冷凍保存溶液,使細(xì)胞濃度為1-5 x 106 cells/ml,混合均勻,分裝于已標(biāo)示完全之冷凍保存管中,1 ml/vial,并取少量細(xì)胞懸浮液作污染檢測(cè)。
3.5. 冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 oC 10 分鐘→ -20 oC 30 分鐘→ -80 oC 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。
3.6. 冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設(shè)定程序之等速降溫機(jī)中,再放入液氮槽中。程序?yàn)? program 7: HB CELL
 

 

 
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