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細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08

細(xì)胞培養(yǎng)的一般過程

一、準(zhǔn)備工作
準(zhǔn)備工作對開展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要,工作量也較大,應(yīng)給予足夠的重視,推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實驗失敗或無法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒,培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌,無菌室或超凈臺的清潔與消毒,培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試,具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
二、取材
在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細(xì)胞(視實驗?zāi)康亩ǎ,?jīng)過一定的處理(如消化分散細(xì)胞、分離等)后接入培養(yǎng)器血中,這一過程稱為取材。如是細(xì)胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。
理論上講各種動物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng),實際上幼體組織(尤其是胚胎組織)比成年個體的組織容易培養(yǎng),分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng),腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理,盡快培養(yǎng),因故不能馬上培養(yǎng)時,可將組織塊切成黃豆般大的小塊,置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時應(yīng)嚴(yán)格保持無菌,同時也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時容易帶菌,為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細(xì)胞的方法可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng),則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部,幾個小時后組織塊可貼牢在底部,再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng),一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),按要求以一定的量(以每毫升細(xì)胞數(shù)表示)接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后,立即放入培養(yǎng)箱中,使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。
正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時間觀察一次,觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好,形態(tài)是否正常,有無污染,培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿(由酚紅指示劑指示),此外對培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養(yǎng)進(jìn)入培養(yǎng)后有一段潛伏期(數(shù)小時到數(shù)十天不等),在潛伏期細(xì)胞一般不分裂,但可貼壁和游走。過了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長期。細(xì)胞長滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng),將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代,而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì),也可能僅有不死性(Immortality)而無惡性。
培養(yǎng)正在生長中的細(xì)胞是進(jìn)行各種生物醫(yī)學(xué)實驗的良好材料。
四、凍存及復(fù)蘇
為了保存細(xì)胞,特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株,要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—-196℃,將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護劑(一般為二甲亞砜或甘油)的培養(yǎng)基,以一定的冷卻速度凍存,最終保存于液氮中。在極低的溫度下,細(xì)胞保存的時間幾乎是無限的。
復(fù)蘇一般采用快融方法,即從液氮中取出凍存管后,立即放入37℃水中,使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
凍存過程中保護劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時溫度、融化速度等都對細(xì)胞活力有影響。

培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)

一、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化
1、差異:細(xì)胞離體后,失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響,生活在缺乏動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定環(huán)境中,日久天長,易發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象減弱;形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時間后衰退死亡;或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,變成可無限生長的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此,培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體,它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能,也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,這種差異就開始發(fā)生了。
雖然體外細(xì)胞與機體細(xì)胞存有差異,但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內(nèi)相同(如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動),只從細(xì)胞遺傳學(xué)(Cyto-genetics)的角度看,離體細(xì)胞仍帶有全套的二倍體基因。細(xì)胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn),只不過是相應(yīng)基因關(guān)閉/開啟引起的現(xiàn)象,這并非是絕對缺陷。恰恰相反,在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功能的喪失,可為該基因的表達(dá)與調(diào)控提供線索。
2、分化;體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失,只是環(huán)境的政變,細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件,如Friend細(xì)胞(小鼠紅白血病細(xì)胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內(nèi)皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時能長成血管狀結(jié)構(gòu),雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體,這些均屬于細(xì)胞分化行為。
二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型
(一)貼附型:大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長,屬于貼壁依賴性細(xì)胞,判斷細(xì)胞形態(tài)時不能接體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定,僅大致分成以下四型:
1、成纖維細(xì)胞型:胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長時呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外,凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外,凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細(xì)胞。
2、上皮型細(xì)胞:細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形,中央有圓形核,細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動,處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連,很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細(xì)胞型:呈散在生長,一般不連成片,胞質(zhì)常突起,呈活躍游走或變形運動,方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定,有時難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。
4、多型細(xì)胞型:有一些細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài),可統(tǒng)歸于此類。
(二)懸浮型;見于少數(shù)特殊的細(xì)胞,如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長。這類細(xì)胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長和增殖過程
體內(nèi)細(xì)胞生長在動態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,則需要分離出一部分細(xì)胞和更新營養(yǎng)液,否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存,這一過程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細(xì)胞的生長和增殖過程都會受一定的影響。另外,很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞,在體外的生存也不是無限的,存在著一個發(fā)展過程。所有這一切,使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點。
(一)培養(yǎng)細(xì)胞生命期(Life Span of Culture Cells)
所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期,是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長的時間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機體的死亡衰老基本相一致。組織和細(xì)胞在培養(yǎng)中生命期如何?這要看細(xì)胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng),在不凍存和反復(fù)傳代條件下,可傳30~50代,相當(dāng)于150~300個細(xì)胞增殖周期,能維待一年左右的生存時間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個體,則生存時間較短;如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞,生存時間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時,細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。對此以后將詳述。
正常細(xì)胞培養(yǎng)時,不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何,在細(xì)胞全生存過程中,大致都經(jīng)歷以下三個階段:
1.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期:
也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動,可見細(xì)胞分裂,但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous),也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同,細(xì)胞相互依存性強。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時,細(xì)胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即細(xì)胞獨立生存性差?寺⌒纬陕始醇(xì)胞群被稀釋分散成單個細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時,形成細(xì)胞小群(克。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型;由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大,是檢測藥物很好的實驗對象。
2.傳代期:
初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續(xù)時間最長。在培養(yǎng)條件較好情況下,細(xì)胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì),細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存,則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10~50次左右,細(xì)胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細(xì)胞進(jìn)入第三期。
3.衰退期:
此期細(xì)胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細(xì)胞形態(tài)輪廓增強,最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段,少數(shù)情況下,在以上三期任何一點(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細(xì)胞永生性也稱不死性,即細(xì)胞獲持久性增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱無限細(xì)胞系(Infinite Cell Line),也稱連續(xù)細(xì)胞系(Continuous Cell Line)。在早期文獻(xiàn)中無限細(xì)胞系也稱已建立細(xì)胞系(Established Cell Line),現(xiàn)已不用。無限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā),轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期
所有體外培養(yǎng)細(xì)胞,包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系,當(dāng)生長達(dá)到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對要快(實際上細(xì)胞接種數(shù)量大時細(xì)胞增殖速度比稀少時要快)。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快,培養(yǎng)液中血清含量多時細(xì)胞增殖比少時快。以上情況都會縮短傳代時間。
所謂細(xì)胞“一代”一詞,系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說法,它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞,即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細(xì)胞一代中,細(xì)胞能倍增3~6次。細(xì)胞傳一代后,一般要經(jīng)過以下三個階段:
1.潛伏期(Latent Phase):
細(xì)胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時細(xì)胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同,這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢,可長達(dá)10~24小時或更多;連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快,10~30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過程。支持物能影響細(xì)胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽性電荷利于貼附。另外在貼附過程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細(xì)胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,它們有的存在于細(xì)胞膜的表面(如 CSP),有的則來自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長增殖條件之一。
細(xì)胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過前述延展過程變成極性細(xì)胞,還要經(jīng)過一個潛伏階段,才進(jìn)入生長和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時,可有運動活動,基本無增殖,少見分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長,約24~96小時或更長,連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短,僅6~24小時;細(xì)胞接種密度大時潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開始出現(xiàn)并逐漸增多時,標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。
2.指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase):
這是細(xì)胞增值最旺盛的階段,細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長旺盛與否的一個重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細(xì)胞群中每1000個細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%~0.5%,初代細(xì)胞分裂指數(shù)低,連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%~5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動對細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最好的時期,因此是進(jìn)行各種實驗最好的和最主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天后,隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞,由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運動,這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細(xì)胞則無接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無接觸抑制能繼續(xù)移動和增殖,導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴展,使細(xì)胞發(fā)生堆積(Piled up)。細(xì)胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營養(yǎng)充分,細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂,因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大,培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時,細(xì)胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個不同的概念,不應(yīng)混淆。
3.停滯期(Stagnate Phase):
細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后,細(xì)胞遂停止增殖,進(jìn)入停滯期。此時細(xì)胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細(xì)胞雖不增殖,但仍有代謝活動,繼而培養(yǎng)液中營養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細(xì)胞會中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應(yīng)越早越好。傳代過晚(已有中毒跡象)能影響下一代細(xì)胞的機能狀態(tài)。在這種情況下,雖進(jìn)行了傳代,因細(xì)胞已受損,需要恢復(fù),至少還要再傳1~2兩代,通過換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后,才能再用。結(jié)果反而耽誤了時間,這是在實驗中應(yīng)特別注意的。

建立細(xì)胞系或細(xì)胞株

各種已被命名和經(jīng)過細(xì)胞生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系或細(xì)胞株,都是一些形態(tài)比較均一、生長增殖比較穩(wěn)定的和生物性狀清楚的細(xì)胞群。因此凡符合上述情況的細(xì)胞群也可給以相應(yīng)的名稱,即文獻(xiàn)中常稱之為已鑒定的細(xì)胞(Certified Cells)。已鑒定的細(xì)胞可用于各種實驗研究和生產(chǎn)生物制品。當(dāng)前世界上已建的各種細(xì)胞系(株)已難勝數(shù),我國也建有百種以上,并在不斷增長中。
一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類和命名
體外培養(yǎng)細(xì)胞的名稱,隨培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和細(xì)胞種類的增多而演變。最早采用的名稱為細(xì)胞株(Cell strain),以后又出現(xiàn)細(xì)胞系(Cell Line)一詞,兩者曾一度混用致概念不明確,導(dǎo)致文獻(xiàn)中也很混亂。我國也曾有類似情況,在我國尚未制定出統(tǒng)一名詞前,本書用的名詞基本參考Schaeffer,W.I.(1979)和國內(nèi)有關(guān)會議、以及國內(nèi)外雜志常用名詞為準(zhǔn)。
(一)初代培養(yǎng)
初代培養(yǎng)又稱原代培養(yǎng),即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)(Subculture)的細(xì)胞,便不再稱為初代培養(yǎng),而改稱為細(xì)胞系。
(二)細(xì)胞系
初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞,即稱之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限,則稱之為有限細(xì)胞系(Finite Cell Line);已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系,稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系(Infinite Cell Line)。無限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化,具異倍體核型,有的可能已成為惡性細(xì)胞,因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無限細(xì)胞系有的只有永生性(或不死性),但仍保留接觸抑制和無異體接種致癌性;有的不僅有永生性,異體接種也有致瘤性,說明已惡性化。這兩種不同性質(zhì)的無限細(xì)胞系,在國內(nèi)外文獻(xiàn)中對這些名詞的應(yīng)用上也常不十分嚴(yán)格。為概念上的明確,本書中對有惡性的無限細(xì)胞系采用“惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系”一詞表示可能更妥。而對那些只具永生性而無惡性的細(xì)胞系,則用無限細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系即可。當(dāng)前流傳的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均屬這類細(xì)胞系。
由某一細(xì)胞系分離出來的、在性狀上與原細(xì)胞系不同的細(xì)胞系,稱該細(xì)胞系的亞系(Subline)。
(三)克隆細(xì)胞株
從一個經(jīng)過生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法,由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群,稱細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群,亦可稱之為亞株(Substrain)
(四)二倍體細(xì)胞
細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同(2n細(xì)胞占75%或80%以上)的細(xì)胞群,稱二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同,而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期,故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同,二倍體細(xì)胞的壽命長短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代,人胚腎只有8~10代,人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞15~30代;如從老齡個體取可傳50則細(xì)胞生存期更短。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長期被利用,一般在初代或2~5代即大量凍存作為原種(Stook Cells),用時再進(jìn)行繁殖,用后再繼續(xù)凍存,可供長期使用或延緩細(xì)胞的衰老。
(五)遺傳缺陷細(xì)胞
從有先天遺傳缺陷者取材(主要為成纖維細(xì)胞)培養(yǎng)的細(xì)胞,或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞,都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類細(xì)胞可能具有二倍體核型,也可呈異倍體。
(六)腫瘤細(xì)胞系或株
這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類,我國已建細(xì)胞系主要為這類細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成,多呈類上皮型細(xì)胞,常已傳幾十代或百代以上,并具有不死性和異體接種致瘤性。
對已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱;細(xì)胞的命名無嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定,大多采用有一定意義縮寫字或代號表示。但不論什么形式,均不宜太長,以便記憶和了解,今別舉以下幾種代表性的細(xì)胞名稱供參考:
HeLa:為供體患者的姓名(來源于宮頸癌)
CHO:中國地鼠卵巢細(xì)胞(Chinese Hamster Ovary)
宮-743:宮頸癌上皮細(xì)胞,1974年3月建立
NIH3T3:美國國立衛(wèi)生研究所(National Institute of Health)建立;每3天傳代,每次接種3×105細(xì)胞/毫升。
二、建立細(xì)胞系(或株)的要求
關(guān)于什么樣的體外培養(yǎng)細(xì)胞群,可被確認(rèn)為是已被鑒定的細(xì)胞(Certified Cells),國際上也尚無統(tǒng)一的規(guī)定,一般依具體情況而定。在只用作初代培養(yǎng)細(xì)胞,只要供體性別、年齡等均一,取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定,做鑒定的項目無需很多,有幾項能說明細(xì)胞的相關(guān)性狀的即可。如能長期保存并可供其它研究室使用,特別是做反復(fù)傳代的細(xì)胞,習(xí)慣上有以下一些要求,并在刊物上報道時應(yīng)加以說明。
(-)組織來源
應(yīng)說明細(xì)胞供體所屬物種,來自人體,動物或其它;供體的年齡、性別、取材的器官或組織;如系腫瘤組織,應(yīng)說明臨床病理診斷,組織來源,以及病例號等。
(二)細(xì)胞生物學(xué)檢測
應(yīng)了解細(xì)胞一般和特殊的生物學(xué)性狀,如細(xì)胞的一般形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長曲線和分裂指數(shù)、倍增時間、接種率;特異性,如為腺細(xì)胞有否特殊產(chǎn)物包括分泌蛋白或激素等;如為腫瘤細(xì)胞,應(yīng)力求證明細(xì)胞確系來源于原腫瘤組織而非其它,并仍保持性性,為此需做軟瓊脂培養(yǎng)、異體動物接種致瘤性和對正常組織浸潤力等實驗。
(三)培養(yǎng)條件和方法
各種細(xì)胞都有自己比較適應(yīng)的生存環(huán)境,因此應(yīng)指明使用的培養(yǎng)基、血清種類、用量以及細(xì)胞生存的適宜pH等。
三、已建立細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用
近些年,當(dāng)一個細(xì)胞系或細(xì)胞林建成后,我國常通過組織專家開鑒定會的形式予以鑒定,從學(xué)術(shù)角度考慮,此舉實非必要。按國際慣例,只要研究認(rèn)真負(fù)責(zé)地把有關(guān)資料在雜志或刊物上報道,詳細(xì)介紹上述各項目即可。
以前因未建立統(tǒng)一的細(xì)胞庫時,對已建立的細(xì)胞系(株)多由作者單位自行保管,有浪費人力、交流使用不便、細(xì)胞易污染和丟失等弊病。我國已初建成小規(guī)模貯存細(xì)胞機構(gòu),待獲進(jìn)一步發(fā)展,這對我國細(xì)胞培養(yǎng)必將有更大促進(jìn)作用。
國際上美、英和日本等國已建有細(xì)胞庫;美國已有美國標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫或細(xì)胞銀行(ATCC)和人遺傳突變細(xì)胞庫(HGMR)、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫(CAR)等,其中ATCC不僅是美國也世界最大的細(xì)胞庫。ATCC下屬有一組協(xié)作實驗室和一個由眾多專家組成的咨詢委員會。ATCC也是美國國立癌癥研究所(NCI)和美國衛(wèi)生研究所中(NIH)的資源庫,尤與NCI有密切的關(guān)系。ATCC也是世界衛(wèi)生組織WHO的國際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心。ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個已經(jīng)過鑒定的細(xì)胞系(1992),其中包括來自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細(xì)胞系;和來自不同物種的近75個雜交瘤細(xì)胞株。ATCC接納來自世界各國已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存,同時也向世界各國的研究者或?qū)嶒炇颐赓M提供研究用細(xì)胞(做盈利性研究時收費。) ATCC接納入庫細(xì)胞時,必須符合其入庫標(biāo)準(zhǔn), ATCC入庫細(xì)胞要求檢測項目如下:
培養(yǎng)簡歷:組織來源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等
凍 存 液:培養(yǎng)基和防凍液名稱
細(xì)胞活力:融解前后細(xì)胞接種存活率和生長特性
培 養(yǎng) 液:培養(yǎng)基種類和名稱(一般要求不含抗生素)、血清來源和含量
細(xì)胞形態(tài):類型,如為上皮或成纖維細(xì)胞等,融解后細(xì)胞生長特性
核 型:二倍體或多倍體,標(biāo)記染色體的有無
無污染檢測:包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲和病毒等
物種檢測:檢測同工酶,主要為G6PD和LDH,以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測
免疫檢測:一兩種血清學(xué)檢測
細(xì)胞建立者:建立者姓名;檢測者姓名
以上為ATCC入庫基本要求,雜交瘤入庫標(biāo)準(zhǔn)尚有所不同,詳細(xì)情況請參閱ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”

 

 

 
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