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培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08
一、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化
1、差異:細(xì)胞離體后,失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響,生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中,日久天長(zhǎng),易發(fā)生如下變化:分化現(xiàn)象減弱;形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡;或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性,變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此,培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體,它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能,也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后,這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。
雖然體外細(xì)胞與機(jī)體細(xì)胞存有差異,但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內(nèi)相同(如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動(dòng)),只從細(xì)胞遺傳學(xué)(Cyto-genetics)的角度看,離體細(xì)胞仍帶有全套的二倍體基因。細(xì)胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn),只不過(guò)是相應(yīng)基因關(guān)閉/開(kāi)啟引起的現(xiàn)象,這并非是絕對(duì)缺陷。恰恰相反,在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功能的喪失,可為該基因的表達(dá)與調(diào)控提供線索。
2、分化;體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失,只是環(huán)境的政變,細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件,如Friend細(xì)胞(小鼠紅白血病細(xì)胞)在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白,血管內(nèi)皮細(xì)胞在類似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時(shí)能長(zhǎng)成血管狀結(jié)構(gòu),雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體,這些均屬于細(xì)胞分化行為。
二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型
(一)貼附型:大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng),屬于貼壁依賴性細(xì)胞,判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能接體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定,僅大致分成以下四型:
1、成纖維細(xì)胞型:胞體呈梭型或不規(guī)則三角形,中央有卵圓形核,胞質(zhì)突起,生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外,凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織,如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外,凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類似時(shí)皆可稱之為成纖維細(xì)胞。
2、上皮型細(xì)胞:細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形,中央有圓形核,細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng),處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連,很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細(xì)胞型:呈散在生長(zhǎng),一般不連成片,胞質(zhì)常突起,呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng),方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定,有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。
4、多型細(xì)胞型:有一些細(xì)胞,如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài),可統(tǒng)歸于此類。
(二)懸浮型;見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞,如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形,不貼于支持物上,呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程
體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中,而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器,生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后,則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液,否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存,這一過(guò)程叫傳代(Passage或Subculture)。每次傳代以后,細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程都會(huì)受一定的影響。另外,很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞,在體外的生存也不是無(wú)限的,存在著一個(gè)發(fā)展過(guò)程。所有這一切,使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。
(一)培養(yǎng)細(xì)胞生命期(Life Span of Culture Cells)
所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期,是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。組織和細(xì)胞在培養(yǎng)中生命期如何?這要看細(xì)胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng),在不凍存和反復(fù)傳代條件下,可傳30~50代,相當(dāng)于150~300個(gè)細(xì)胞增殖周期,能維待一年左右的生存時(shí)間,最后衰老凋亡(Apoptosis)。如供體為成體或衰老個(gè)體,則生存時(shí)間較短;如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞,生存時(shí)間更短,僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變,如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí),細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。對(duì)此以后將詳述。
正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),不論細(xì)胞的種類和供體的年齡如何,在細(xì)胞全生存過(guò)程中,大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段:
1.原代培養(yǎng)(Primary Culture)期:
也稱初代培養(yǎng),即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段,一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng),可見(jiàn)細(xì)胞分裂,但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的(Heterogeneous),也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同,細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞,在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),細(xì)胞克隆形成率(Cloning Efficiency)很低,即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),形成細(xì)胞小群(克。┑陌俜?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型;由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大,是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
2.傳代期:
初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱做細(xì)胞系(Cell Line)。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下,細(xì)胞增殖旺盛,并能維持二倍體核型,呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系(Diploid Cell Line)。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì),細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存,則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度,以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10~50次左右,細(xì)胞增殖逐漸緩慢,以至完全停止,細(xì)胞進(jìn)入第三期。
3.衰退期:
此期細(xì)胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖;細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng),最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段,少數(shù)情況下,在以上三期任何一點(diǎn)(多發(fā)生在傳代末或衰退期),由于某種因素的影響,細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化(Spontaneous Transformation)。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性(Immortality)或惡性性(Malignancy)。細(xì)胞永生性也稱不死性,即細(xì)胞獲持久性增殖能力,這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系(Infinite Cell Line),也稱連續(xù)細(xì)胞系(Continuous Cell Line)。在早期文獻(xiàn)中無(wú)限細(xì)胞系也稱已建立細(xì)胞系(Established Cell Line),現(xiàn)已不用。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末,或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后,核型大多變成異倍體(Heteroploid)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā),轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。
(二)組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期
所有體外培養(yǎng)細(xì)胞,包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系,當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后,都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下,細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快(實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比稀少時(shí)要快)。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快,培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。
所謂細(xì)胞“一代”一詞,系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間,這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法,它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞,即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代(Generation)或倍增〔Doubling)不同;在細(xì)胞一代中,細(xì)胞能倍增3~6次。細(xì)胞傳一代后,一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段:
1.潛伏期(Latent Phase):
細(xì)胞接種培養(yǎng)后,先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮,胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上,稱貼壁,懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同,這與細(xì)胞的種類、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢,可長(zhǎng)達(dá)10~24小時(shí)或更多;連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快,10~30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過(guò)程。支持物能影響細(xì)胞的貼附;底物表面不潔不利貼附,底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附。另外在貼附過(guò)程中,有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素(Fibronectin),又稱LETS(Larger External Transformation Substance),細(xì)胞表面蛋白(Cell Surface Protein:CSP)等也參與貼附過(guò)程。這些物質(zhì)都是蛋白類成分,它們有的存在于細(xì)胞膜的表面(如 CSP),有的則來(lái)自培養(yǎng)基中的血清(LETS)。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。
細(xì)胞貼附于支持物后,除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞,還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段,才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí),可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng),基本無(wú)增殖,少見(jiàn)分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng),約24~96小時(shí)或更長(zhǎng),連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短,僅6~24小時(shí);細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí),標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。
2.指數(shù)增生期(Logarithmic growth Phase):
這是細(xì)胞增值最旺盛的階段,細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂(Mitotic Index:MI)表示,即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%~0.5%,初代細(xì)胞分裂指數(shù)低,連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%~5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期,因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下,指數(shù)增生期持續(xù)3~5天后,隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后,如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞,由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng),這種現(xiàn)象稱接觸抑制(Contact Inhibition)。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象,因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無(wú)接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖,導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展,使細(xì)胞發(fā)生堆積(Piled up)。細(xì)胞接觸匯合成片后,雖發(fā)生接觸抑制,只要營(yíng)養(yǎng)充分,細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂,因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大,培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少,代謝產(chǎn)物增多時(shí),細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響,則發(fā)生密度抑制(Density Inhibition),導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念,不應(yīng)混淆。
3.停滯期(Stagnate Phase):
細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后,細(xì)胞遂停止增殖,進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加,故也稱平頂期(Plateau)。停滯期細(xì)胞雖不增殖,但仍有代謝活動(dòng),繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡,代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代,否則細(xì)胞會(huì)中毒,發(fā)生形態(tài)改變,重則從底物脫落死亡,故傳代應(yīng)越早越好。傳代過(guò)晚(已有中毒跡象)能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下,雖進(jìn)行了傳代,因細(xì)胞已受損,需要恢復(fù),至少還要再傳1~2兩代,通過(guò)換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后,才能再用。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間,這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。
 

 

 
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